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研究生:賴智群
研究生(外文):Chin-Chun Lai
論文名稱:牛樟芝1-吡咯啉-5-羧酸去氫酶之基因選殖、表現及酵素特性分析
論文名稱(外文):Gene cloning, expression and characterization of 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase from Taiwanofungus camphorata
指導教授:林棋財
指導教授(外文):Chi-Tsai Lin
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2013
畢業學年度:101
語文別:中文
論文頁數:51
中文關鍵詞:牛樟芝1-吡咯啉-5-羧酸去氫酶尿素循環
外文關鍵詞:Taiwanofungus camphorata1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenaseurea cycle
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1-吡咯啉-5-羧酸去氫酶(1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase ; P5CD) 為醛類去氫酶家族中,分類於第四號。其代謝過程主要發生在粒線體中,屬於NAD+依賴型的酵素。在尿素循環中可將其代謝物氧化成穀胺酸(Glutamate)。本實驗從牛樟芝(Taiwanofungus camphorata)中選殖出P5CD的cDNA (TcP5CD),全長1935個鹼基對,轉譯區為1641個鹼基對,可轉譯出547個胺基酸,其預測分子量大小為59.4 kDa。將轉譯區重組至表現載體pET-20b(+),並轉形到E. coli Rosetta (DE3)表現蛋白質,再由鎳離子親和管柱純化,進行12% SDS-PAGE,可看出明顯色帶。以3,5-二甲氧基苯甲醛(3,5-dimethoxybenzaldehyde )作為基質,分析 TcP5CD 還原基質之酵素動力學及其特性,以NAD+作為輔酶者,得KM為0.557 mM,則另一個以NADP+做輔酶者,得KM為3.93 mM。在45℃下,半衰期為4.4 min,而熱失活常數(kd) 則是1.23 x 10-2 min-1 。TcP5CD 置於pH 5.8 - 8.0的環境處理下,仍具有活性,但以pH 3.0處理後,僅存不到20 %的活性。又另外以乙醛(acetaldehyde)、丙醛 (propionaldehyde) 、藜蘆醛(veratraldehyde)作為基質,分析TcP5CD氧化基質之活性,當中以藜蘆醛活性最佳。
1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase (P5CD; EC 1.5.1.12) belongs
to family IV of aldehyde dehydrogenase, a mitochondrial matrix NAD+-dependent. In metabloism, ornithine of the products of the urea cycle, is converted into proline and 1-pyrroline-5-carboxylate (P5C), then catalyze the oxidation of P5C to glutamate by P5CD. A cDNA encoding 1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase from Taiwanofungus camphorata (formerly named Antrodia camphorata) was cloned by PCR (TcP5CD). It contains an open reading frame of 1,641 bp which encodes a protein of 547 amino acid residues, molecular mass is 59.4 kDa. To characterize the TcP5CD protein, the coding region was subcloned into both, an expression vector pET-20b(+) transformed into E. coli Rosetta (DE3). The recombinant His6-tag TcP5CD was expressed and purified by Ni2+-nitrilotriacetic acid agarose. The purified enzyme showed bands on 12% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The Michaelis constant (KM) value for 3,5-dimethoxybenzaldehyde with NAD+ and NADP+ were 0.557 mM and 3.93mM. Half-life of the enzyme at 45C was 4.4 min, and its thermal inactivation rate constant kd was 1.23 x 10-2 min-1. The enzyme was most active at pH 7.0. The enzyme’s preferred substrate is veratraldehyde. Other aldehydes can be used as substrates including acetaldehyde, propionaldehyde and veratraldehyde.

謝辭 I
摘要 II
Abstract III
縮寫表 IV
目錄 V
第一章 前言 1
第一節 牛樟芝(Taiwanofungus camphorata) 1
第二節 1-吡咯啉-5-羧酸去氫酶 1
第三節 高脯胺酸血症 2
第四節 研究動機 2
第二章 實驗部份 3
第一節 實驗設計概念 3
第二節 實驗儀器及試藥 4
一、物種 4
二、載體 4
三、宿主 4
四、培養基 5
五、套組 5
六、儀器 6
七、耗材 7
八、藥品試劑 7
九、引子設計 9
第三節 實驗方法 10
一、牛樟芝1-吡咯啉-5-羧酸去氫酶基因之選殖及分析 10
二、TcP5CD基因之建構 12
三、TcP5CD重組蛋白之表現與純化 15
四、TcP5CD之酵素活性與特性分析 17
第三章 實驗結果 22
第一節 TcP5CD基因之選殖 22
一、5’RACE與3’RACE選殖TcP5CD 22
二、TcP5CD 全長cDNA 23
第二節 TcP5CD結構分析 23
一、胺基酸序列分析 23
二、蛋白質結構分析 23
第三節 TcP5CD之表現與純化 24
一、建構表現系統 24
二、TcP5CD之表現及純化 24
第四節 TcP5CD活性與特性分析 24
一、TcP5CD活性測定 24
二、酵素動力學分析 25
三、熱穩定性分析 25
四、pH耐受性 25
五、不同基質活性之測定 26
六、酵素還原反應 26
第四章 討論 26
參考文獻 28
附錄 38


郭家瑜, 2012, Rigidoporus vinctus漆氧化酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文
朱禹婷, 2012, 牛樟芝NAD+依賴型甲醇脫氫酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文
張哲綺, 2012, 牛樟芝芳基醇脫氫酶之基因選殖、表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文
蔡葳葳, 2012, 樟芝2,3-丁二醇之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學 生物科技研究所 碩士學位論文
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