(3.236.6.6) 您好!臺灣時間:2021/04/22 18:55
字體大小: 字級放大   字級縮小   預設字形  
回查詢結果

詳目顯示:::

我願授權國圖
: 
twitterline
研究生:周宗龍
研究生(外文):Tzung-Lung Chou
論文名稱:牛樟芝1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶基因選殖、表現與特性分析
論文名稱(外文):Cloning, expression and characterization of 1,2,4-trihydroxybenzene 1,2-dioxygenase from Taiwanofungus camphoratus
指導教授:林棋財
指導教授(外文):Chi-Tsai Lin
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2013
畢業學年度:101
語文別:中文
論文頁數:83
中文關鍵詞:124-苯三酚12-雙加氧酶124-苯三酚馬來醯乙酸牛樟芝子實體模擬立體結構
相關次數:
  • 被引用被引用:0
  • 點閱點閱:333
  • 評分評分:系統版面圖檔系統版面圖檔系統版面圖檔系統版面圖檔系統版面圖檔
  • 下載下載:24
  • 收藏至我的研究室書目清單書目收藏:1
1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶 (hydroxyquinol 1,2-dioxygenase, HQD) 扮演降解1,2,4-苯三酚 (hydroxyquinol, 1,2,4-trihydroxybqnzene, HQ) 生成馬來醯乙酸 (maleylacetate)。本篇研究從牛樟芝子實體cDNA庫選殖出HQD cDNA序列,全長共1,233個核苷酸,內含開放譯讀區1,036個核苷酸,可轉譯出344個胺基酸。經序列比較TcHQD與其它物種序列具有相似性,並依據PpHQD (Psudomonas putida;PDB code 3N9T_A) 已知結構模擬出一個TcHQD的立體結構。進一步將開放譯讀區選殖入表現載體pYEX-S1,以酵母菌Saccharomyces cerevisiae作為表現,經親和性管柱純化後執行SDS-PAGE可觀察到蛋白質色帶位於35.0 kDa的位置。其特性在pH 6.0與pH 7.0相較之下耐受性僅剩41%,在酵素動力學試驗中其KM參數值為36.68 μM,在58℃反應之半衰期為4.89 min及其熱失活常數kd值為1.93×〖10〗^(-3) min-1。
Hydroxyquinol 1,2-dioxygenase (HQD) plays an important role in aromatic-compound degradation system. HQD catalyzed hydroxyquinol (1,2,4-trihydroxybenzene, HQ) and produced maleylacetate formation. In this study, a full length cDNA (1,233 bp) encoding a putative HQD from fruiting bodies of Taiwanofungus camphorata was cloned, the open reading frame has 1,035 nucleotides and encodes 344 amino acids. The deduced amino acid sequence is similar to the HQDs from other species. A 3-D structural model of TcHQD was built based on the crystal structure of PpHQD (Psudomonas putida; PDB code 3N9T_A). To further characterize the TcHQD, the coding region was subcloned into an expression vector pYEX-S1 and transformed into Saccharomyces cerevisiae. Subsequently, the purified enzyme showed a single band at molecular mass of approximately 35.0 kDa on 12 % polyacrylamide gel after SDS-PAGE. Furthermore, it was left over 41% at pH 6.0 compaired with pH 7.0 with the enzyme tolerance, the Michaelis constant value (KM) for hydroxyquinol was 36.68 μM, the thermal inactivation of the enzyme showed a half-life of 4.89 min at 58℃ and the inactivation rate constant kd was 1.93×〖10〗^(-3) min-1.
摘要 Ⅰ
Abstract Ⅱ
縮寫表 Ⅲ
目錄 Ⅳ

第一章、 前言 1
第一節、 緒論 1
第二節、 芳香環降解系統 1
第三節、 內開環雙加氧酵素 3
第四節、 牛樟芝 3
第五節、 研究目的 4
第二章、 實驗材料 5
第一節、 生物性材料 5
第二節、 儀器設備 6
第三節、 套組試劑 6
第四節、 藥品試劑 7
第五節、 引子設計 9
第六節、 其它耗材 10
第七節、 資訊工具 10
第三章、 實驗方法 11
第一節、 選殖與構築 11
1. 牛樟芝子實體mRNA萃取及其cDNA合成 11
2. 芳香環化合物雙加氧酵素之全基因聚合酶鏈鎖反應 11
3. 芳香環化合物雙加氧酵素之次選殖聚合酶鏈鎖反應 13
4. 瓊脂凝膠電泳 13
5. 基因片段純化 14
6. 選殖載體接合反應 14
7. 選殖宿主轉型反應 14
8. 菌落篩選 15
9. 目標基因分析 15
10. 目標基因構築於pET-20b(+) 15
11. 目標基因構築於pYEX-S1 17
12. 表現宿主轉型反應 19
第二節、 表現與純化 20
1. rTcHQD基因表現 20
2. rTcHQD蛋白質純化 22
3. rTcHQD蛋白質透析 24
4. rTcHQD蛋白質定量 25
第三節、 特性分析 25
1. rTcHQD酵素動力學參數分析 25
2. rTcHQD酸鹼耐受性分析 28
3. rTcHQD溫度穩定性分析 29
第四節、 統計 32
第四章、 實驗結果 33
第一節、 TcHQD選殖與構築 33
第二節、 TcHQD相似度分析 34
第三節、 rTcHQD表現與純化 35
第四節、 rTcHQD酵素動力學分析 35
第五節、 rTcHQD酸鹼耐受性分析 37
第六節、 rTcHQD溫度穩定性分析 37
第五章、 討論 47

References 50
Supplementary 57
Appendix 74

王付轉,2010,釀酒酵母的絮凝研究。信陽師範學院學報、河南工業大學生物工程學院、中國河南,23(4):636-639。

王伯徹、黃仁彰,2002,靈芝與樟芝之研發與市場面面觀。保健用菇之研發專輯、食品工業發展研究所、臺灣新竹,349(5):3-17。

王佳堃、孫中遠、劉建新,2011,酵母細胞表面展示技術。動物營養學報、動物分子營養學教育部重點實驗室、浙江大學奶業科學研究所、中國浙江,23(11):1847-1853。

朱禹婷,2012,牛樟芝NAD+依賴型甲醇脫氫酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

李學霖,2011,使用Shewanella decolorationis NTOU1/膽紅素氧化脢做為陽/陰極生物性觸媒之微生物燃料電池以增進生物產氫程序之能源回收。國立成功大學環境工程學系博士論文、臺灣臺南。

施秋榮,2002,偏臨苯二酚雙加氧酶的基理型抑制反應 — 3-胺基甲基兒茶酚的合成與反應機構探討。國立成功大學化學系碩士論文、臺灣臺南。

孫雯、許麗、張雙宇、田健、初曉宇、伍寧豐,2009,來源於假單孢菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-雙加氧酶基因克隆和功能鑑定。中國農業科技學報、中國農業科學院生物技術研究所、中國北京,11(4):71-76。

孫艷、錢世鈞,2001,芳香族化合物生物降解的研究進展。生物工程進展、中國科學院微生物研究所、中國北京,21(1):42-46。

孫智麗,2006,因應生物經濟時代來臨之科技發展策略。台灣經濟研究月刊、臺灣經濟研究院生物科技產業研究中心、臺灣臺北,29(3):14-21。

陳怡靜,2009,樟芝單硫型穀氧還蛋白之基因選殖、表現及特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

郭家瑜,2012,Rigidoporus vinctus漆氧化酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

張哲綺,2012,牛樟芝芳基醇脫氫酶之基因選殖、表現及酵素特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

詹雯婷,2013,牛樟菇子實體之安全性應以衛生署規定之相關檢測為準,生技中心初步試驗結果仍須進一步驗證。澄清新聞稿、財團法人生物技術開發中心、臺灣新北。

廖怡珍,2006,樟芝2-Cys peroxiredoxin之基因選殖及其特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

劉松鈴,2005,樟芝子實體EST之建立與Cytochrome P450、Glutathione-S-transferase、Peroxiredoxin之表現、性質分析與動力學研究。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

蔡薇薇,2012,牛樟芝2,3-丁二醇脫氫酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析。國立臺灣海洋大學生物科技研究所碩士論文、臺灣基隆。

韓雙艷、韓振林、林影、鄭穗平,2010,高效絮凝素畢赤酵母表面展示系統的建構。生物化學與生物物理進展、華南理工大學生物工程系、中國廣東,37(2):200-207。

Birgit Morawski, Zhanglin Lin, Pat Cirino, Hyun Joo, Geethani Bandara and Frances H. Arnold, 2000. Functional expression of horseradish peroxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris. Protein Engineering 13(5): 377-384.

Christian Vogel, Hans-Günther, 1967. Benzene oxide-oxepin valence tautomerism. Angewandte Chemie International Edition in English 6: 385-401.

Danilo Pérez-Pantoja, Raúl Donoso, Loreine Agulló, Macarena Córdova, Michael Seeger, Dietmar H. Pieper and Bernardo González, 2012. Genomic analysis of the potential for aromatic compounds biodegradation in Burkholderiales. Environmental Microbiology 14(5): 1091-1117.

Dayna L. Daubaras, Katsuhiko Saido, and A. M. Chakrabarty, 1996. Purification of hydroxyquinol 1,2-dioxygenase and maleylacetate reductase: the lower pathway of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid metabolism by Burkholderia cepacia AC1100. Applied Environmental Microbiology 62(11): 4276-4279.

Elizabeth A. Packham, Ian R. Graham and Alistair Chambers, 1996. The multifunctional transcription factors Abf1p, Rap1p and Reb1p are required for full transcriptional activation of the chromosomal PGK gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics 250: 348-356.

Eric T. Boder and K. Dane Wittrup, 1997. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nature Biotechnology 15: 553-557.

Frédéric H. Vaillancourt, Jeffrey T. Bolin and Lindsay D. Eltis, 2006. The Ins and Outs of ring-cleaving dioxygenases. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 41: 241–267.

Haiying Yu, Zixin Peng, Yuhua Zhan, Jin Wang, Yongliang Yan, Ming Chen, Wei Lu, Shuzhen Ping, Wei Zhang, Zhonglin Zhao, Shuying Li, Masahiro Takeo and Min Lin, 2011. Novel regulator MphX represses activation of phenol hydroxylase genes caused by a XylR/DmpRType regulator MphR in Acinetobacter calcoaceticus. PLoS ONE 6(3): e17350.

Isaac S. Y. Sze and Stanley Dagley, 1984. Properties of salicylate hydroxylase and hydroxyquinol 1,2-dioxygenase purified from Trichosporon cutaneum. Journal of Bacteriology 159(1): 353–359.

J.A. Buswell and K. E. Eriksson, 1979. Aromatic ring cleavage by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. FEBS Letter 104: 258-260.

Kathryn Leake, Jyotsana Singhal, Lokesh Dalasanur Nagaprashantha, Sanjay Awasthi, Sharad S. Singhal, 2012. RLIP76 regulates PI3K/Akt signaling and chemo- radiotherapy resistance in pancreatic cancer. PLoS ONE 7(4): e34582.

Lynda L. Perry and Gerben J. Zylstra, 2007. Cloning of a gene cluster involved in the catabolism of p-nitrophenol by Arthrobacter sp. strain JS443 and characterization of the p-nitrophenol monooxygenase. Journal of Bacteriology 189(21): 7563–7572.

Markus Latus, Hans-Jürgen Seitz, Jürgen Eberspächer and Franz Lingens, 1995. Purification and characterization of hydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Azotobacter sp. strain GP1. Applied Environmental Microbiology 61(7): 2453-2460.

Marta Ferraroni, Jana Seifert, Vasili M. Travkin, Monika Thiel, Stefan Kaschabek, Andrea Scozzafava, Ludmila Golovleva, Michael Schlo¨mann, and Fabrizio Briganti, 2005. Crystal structure of the hydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Nocardioides simplex 3E, a key enzyme involved in polychlorinated aromatics biodegradation. The Journal of Biological Chemistry 280: 21144-21154.

Matthew W. Vetting and Douglas H. Ohlendorf, 2000. The 1.8 Å crystal structure of catechol 1,2-dioxygenase reveals a novel hydrophobic helical zipper as a subunit linker. Cell Structure 8(4): 429-440.

Min Wei, Jun-Jie Zhang, Hong Liu and Ning-Yi Zhou, 2010. para-Nitrophenol 4-monooxygenase and hydroxyquinol 1,2-dioxygenase catalyze sequential transformation of 4-nitrocatechol in Pseudomonas sp. strain WBC-3. Biodegradation 21: 915–921.

Olga Zaborina, Dayna L. Daubaras, Anna Zago, Luying Xun, Katauhiko Saido, Thomas Klem, Dejan Nikolic and A. M. Chakrabarty, 1998. Novel pathway for conversion of chlorohydroxyquinol to maleylacetate in Burkholderia cepacia AC1100. Journal of Bacteriology 180(17): 4667–4675.

Olga Zaborina, Markus Latus, Jürgen Eberspächer, Ludmila A. Golovleva, and Franz lingens, 1995. Purification and characterization of 6-chlorohydroxyquinol 1,2-dioxygenase from Streptomyces rochei 303: comparison with an analogous enzyme from Azotobacter sp. strain GP1. Journal of Bacteriology 177(1): 229–234.

Shuangyu Zhang, Wen Sun, Li Xu, Xiaomei Zheng, Xiaoyu Chu, Jian Tian, Ningfeng Wu and Yunliu Fan, 2012. Identification of the para-nitrophenol catabolic pathway, and characterization of three enzymes involved in the hydroquinone pathway, in Pseudomonas sp. 1-7. BMC Microbiology 12: 27.

Shuichiro Murakami, Takao Okuno, Eitaro Matsumura, Shinji Takenaka, Ryu Shinke and Kenji Aoki, 1999. Cloning of a gene encoding hydroxyquinol 1,2-dioxygenase that catalyzes both intradiol and extradiol ring cleavage of catechol. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 63(5): 859-865.

Siegfried Rieble, Dinesh K. Joshi and Michael H. Gold, 1994. Purification and characterization of a 1,2,4-trihydroxybenzene 1,2-dioxygenase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium. Journal of Bacteriology 176(16): 4838-4844.

Tang Li, Kexin Zhao, Yan Huang, Defeng Li, Cheng-Ying Jiang, Nan Zhou, Zheng Fan and Shuang-Jiang Liu, 2012. The TetR-type transcriptional repressor RolR from Corynebacterium glutamicum regulates resorcinol catabolism by binding to a unique operator, rolO. Applied Environmental Microbiology 78: 6009-6016.

Wataru Kitagawa, Nobutada Kimura and Yoichi Kamagata, 2004. A novel p-nitrophenol degradation gene cluster from a gram-positive bacterium, Rhodococcus opacus SAO101. Journal of Bacteriology 186(15): 4894–4902.

連結至畢業學校之論文網頁點我開啟連結
註: 此連結為研究生畢業學校所提供,不一定有電子全文可供下載,若連結有誤,請點選上方之〝勘誤回報〞功能,我們會盡快修正,謝謝!
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
第一頁 上一頁 下一頁 最後一頁 top
1. 郭生玉(民79)。工作壓力與專業態度對教師工作新厭高低之區別弁酮膍s。教育心理學報,23,71-98。
2. 郭生玉(民81)。國小、國中和高中教師工作心厭之比較研究。國立台灣師範大學教育研究所,教育心理學報,25,67-79。
3. 郭生玉(民78)。教師工作壓力與工作心厭關係之研究。國立台灣師範大學教育研究所,教育心理學報,22,31-146。
4. 林炎旦(民84)。國民小學教師教學倦怠之研究。國立嘉義師院初等教育研究所,國民教育研究學報,1,57-84。
5. 林生傳(民79b)。國中教師專業行為之主要參照團體研究。教育學刊,9,263-292。
6. 沈亞梵(民82)。視聽教學媒體的認識與應用。教學科技與媒體,10,40-42。
7. 郭生玉(民83)。影響教師工作心厭因素之分析研究。國立台灣師範大學教育研究所。教育心理學報,27,63-79。
8. 楊東林(民85)。找到春天活出春天—關於我的班級經營。班級經營,1(1),44-46。
9. 趙鎮州(民79)。國民小學級任教師工作負擔極其影響之研究。國教學報,3,111-118。
10. 歐用生(民83)。做一個有反省能力的教師。研習資訊,11(5),1-6。
11. 歐陽教(民77)。教學的哲學分析。現代教育,2(2),32-42。
12. 劉安彥(民83)。運用動機來促進學生學習。教育資料與研究,1,37-43。
13. 簡茂發等(民86)。中小學教師應具備的基本素質。教育研究資訊,5(3),1-13。
14. 王伯徹、黃仁彰,2002,靈芝與樟芝之研發與市場面面觀。保健用菇之研發專輯、食品工業發展研究所、臺灣新竹,349(5):3-17。
 
系統版面圖檔 系統版面圖檔