臺灣博碩士論文加值系統

在近幾年來，Acinetobacter baumannii (A. baumannii)在台灣已經成為院內感染主要的細菌，主要原因來自於A. baumannii已發展出具有多重抗藥性的能力，讓一般常用的抗生素失去了治療效果，再加上A. baumannii的致死率高，造成更多的醫療花費。雖然A. baumannii的抗藥性強，但是不同菌株都存有個體間差異，並非所有A. baumannii都有能力造成病人死亡，而根據菌株的致死率，可以將其區分為高低毒性菌株，但目前仍然無法確定造成高低毒性菌株的原因。因此在此研究中，希望能鑑定出高毒性菌株的基因與特性，並找尋可能的作用機制。
為了鑑定出高毒性菌株的基因，所以利用臺大醫院提供的三株已組成contig的A. baumannii序列資料，配合目前已發表在NCBI上的九株菌株，採用同源基因的關係，先找出可能在不同菌株內的相同基因，建立成基因表格，使其包含所有已知A. baumannii的相關基因。之後藉由比較基因有無的方式，觀察在高毒性菌株中特有的基因，因此將不同毒性菌株的定序資料(reads)對應到參考序列上，找尋有差異的基因。在找出候選基因後，設計聚合酶反應鏈(PCR)實驗，驗證其他高毒性菌株是否都有候選基因存在，為了在大量的菌株中，使用相同的PCR引子，所以盡量將引子設計在高保留性的序列上，但在不同菌株之間有許多變異存在，因此藉由定序資料找出並避開變異點位置，以提高引子的效率，最後進行實驗。
在高低毒性菌株的基因比較中，找出約一百個有差異的候選基因，有許多都是和噬菌體相關基因，導致毒性增加；部分候選基因，也能在已知的毒性因子資料庫中搜尋到。一旦有了候選基因，藉由定序資料收集所有的變異，可以自動地將PCR引子設計在高保留性的區段上，目前正在實驗驗證的階段。此分析方法也可以應用在兩群不同特性的細菌，比較兩群細菌之間可能的基因差異，並產生候選基因，而且自動化產生候選基因的引子，方便在大量菌株中進行PCR實驗。

Acinetobacter baumannii becomes a major opportunistic bacterial pathogen and increases the emergence and rapid spreading of multidrug-resistant strain in Taiwan. The ability of Acinetobacter baumannii to cause diseases in a susceptible host is determined by their virulence factors. The high virulence strains of some pathogenic bacteria, like Acinetobacter baumannii, might be evolved from low-virulence flora through acquired genetic changes. If the virulence factors can be detected, the targets for the treatment will be clear. Thus, prevention and diagnosis will become possible.
Finding virulence factors of pathogenic bacteria was difficult in the past. One commonly used approach is to compare the sequences of bacterial genes with those of known virulence factors collected in GenBank or the Virulence Factor Database (VFDB). However, such an approach will not work if the virulence factor for a new high-virulence strain is yet to be characterized. Other approaches like expression profiling are of limited power since they may miss the genetic variants underlying the differential patterns. In this study, a pipeline that took advantage of next-generation sequencing (NGS) technology to pinpoint the genes gained or lost in high-virulence strains was established. The gene gain or gene loss among different bacterial strains could be used to detect the virulence factors.
First, we prepared the non-redundant gene table that contained the all the genes ever annotated in the Acinetobacter baumannii under investigation. All genome sequences of known strains belonging to this species were retrieved from GenBank and were used as the references for the later gain-and-loss analysis. Then the Ensembl annotation and compara pipelines were performed to create the “gene tree”. Ensembl gene tree provides the orthology/paralogy relation of all genes across different strains, so a non-redundant gene table could be generated on the basis of the gene tree. Second, to locate gained or lost genes, NGS reads of the high- and low- virulence strains isolated from different patients were aligned to the reference genomes. If the length coverage of a set of NGS data to a particular gene is over 90%, this gene would be regarded as being “present” in this strain, and vice versa. After that, genes enriched in high- or low- virulence strains were retrieved as candidate virulence factors. Third, Primer3 was used to design PCR primers with the consensus sequence of each candidate region. To avoid producing multiple PCR products, only primers uniquely mapped to the reference genomes were preserved.
In the results, this pipeline discovered ~100 candidate virulence factors. Interestingly, many of them have been suggested to be virulence factors in other bacterial species, such as phage-like genes and proteins. In summary, this pipeline provides a systematic approach, which can be easily applied to identifying the causative genes of infections or drug-resistant genes in different prokaryotes. A pipeline to design PCR experiments was also established to detect the candidate genes exist in other high-virulence isolates. This pipeline proves to be effective for validating candidate virulence factors.

目錄
誌謝 i
中文摘要 ii
Abstract iv
目錄 vii
圖目錄 xi
表目錄 xvi
Chapter 1 緒論 1
1.1 研究Acinetobacter baumannii的重要性 1
1.2 Acinetobacter baumannii 3
1.2.1 不動桿菌屬 4
1.2.2 醫院中A. baumannii常棲息處 5
1.2.3 辨識A. baumannii的方法 5
1.3 研究現況 7
1.3.1 已定序的A. baumannii菌株沒有足夠的臨床與流行病學資訊 7
1.3.2 對A. baumannii大部分的研究都是針對抗藥性 8
1.3.3 對毒性的瞭解相當有限 9
1.4 研究目標 11
Chapter 2 研究原理 12
2.1 將定序資料對應到參考序列 12
2.1.1 組裝序列的困難處 12
2.1.2 選擇利用對應到基因體的方式 14
2.2 建立基因總表作為比較的依據 14
2.2.1 利用基因比較不同個體之間的差異 14
2.2.2 A. baumannii目前沒有標準的參考序列可供使用 15
2.2.3 建立基因總表分析不同菌株的基因差異 16
Chapter 3 材料與方法 18
3.1 A. baumannii基因體序列資料來源 18
3.1.1 NCBI下載 18
3.1.2 臺大醫院定序菌株 18
3.2 基因預測 19
3.3 基因體序列相似性比較 20
3.4 上傳至Ensembl資料庫 21
3.5 預測基因的功能性區域 21
3.6 鑑別基因的親緣關係 22
3.7 比較特定序列的相似性 24
3.8 利用Samtools擷取序列排比資料中的資訊 24
3.9 判斷基因是否存在於定序資料中的依據 25
3.10 預測A. baumannii中可能出現的噬菌體片段 26
3.11 確認預測的毒性因子是否是已知的 27
3.12 設計Primer驗證預測的毒性因子 27
Chapter 4 結果 28
4.1 參考菌株之比較 28
4.1.1 菌株的基因體序列之間差異不大 28
4.1.2 兩株已組裝菌株之基因預測結果 31
4.1.3 各參考菌株含有特有的基因存在 33
4.2 建立基因總表，作為比較依據 34
4.2.1 收集目前已知的基因體與註解資訊 35
4.2.2 找出基因在不同菌株之間的親緣關係 35
4.3 比較不同毒性菌株基因層次的差異 41
4.3.1 定序資料對應到各個參考菌株之結果 42
4.3.2 根據基因總表決定不同毒性菌株中包含的基因 43
4.3.3 比較基因在不同毒性菌株的多寡 46
4.4 註解候選毒性基因 48
4.4.1 根據基因的註解分類 48
4.4.2 假設性蛋白大量存在於差異基因中(Hypothetical protein) 49
4.4.3 有些毒性菌株含有噬菌體的部分序列 50
4.4.4 搜尋有差異的基因是否是已知的毒性相關因子 57
4.5 設計驗證候選基因使用的PCR引子對 60
4.5.1 候選基因之列表 61
4.5.2 產生在不同已組合的菌株中，基因高度保留的序列 62
4.5.3 在Primer3程式中避開變異點設計驗證用的引子對 65
Chapter 5 討論 68
5.1 流行病的增加，新的抗藥菌種出現 68
5.1.1 此分析流程可以對不同分類的群組快速找出基因差異 68
5.2 以A. baumannii為例的比較結果 69
5.2.1 收集A. baumannii所有基因當作是比較依據 69
5.2.2 無法找出高毒性菌株共有但在低毒性菌株沒有的基因 69
5.2.3 發現噬菌體基因出現在A. baumannii的基因體中 70
5.2.4 噬菌體下游的LPS相關基因不在已知的合成LPS反應路徑中 73
5.2.5 驗證候選基因是否可以區分高低毒性菌株的差別 75
5.2.6 此本次研究的限制 75
5.3 未來展望 77
參考文獻 81

圖目錄
Figure 1 在葛蘭氏染色法下觀察到的A.baumannii ，箭頭所指為A. baumannii個體(Howard et al., 2012) 3
Figure 2 從電子顯微鏡下觀察到的A. baumannii (McConnell et al., 2012) 4
Figure 3在基因體中會因為重複序列，使得組裝序列時產生許多相似序列，造成在判斷序列時的困難。 13
Figure 4 在組裝序列時也會因為具有重複序列的關係，導致組裝完的序列不知道哪一個是正確的基因體序列順序。 13
Figure 5 比較基因差異之分析流程。 17
Figure 6 Ensembl預測基因關係之流程(Vilella et al., 2009) 23
Figure 7 定序深度與定序長度覆蓋率之示意圖。 26
Figure 8利用Dotplot比較NCBI上的菌株之間基因體的相似程度，彼此的相似程度都大於90%以上。 29
Figure 9 臺大醫院兩株以組裝的菌株與NCBI上的九株菌株之基因體序列比較。 30
Figure 10 兩株已組裝菌株之基因體之比較 30
Figure 11建立基因總表之流程圖。 34
Figure 12 以AYE菌株的ABAYE2404基因為例，可以藉由Ensembl Gene Tree的流程，找出ABAYE2404基因在其他菌株中是否也有存在相同的基因。 36
Figure 13利用Ensembl 提供的方法Gene Tree找出在各菌株之間的orthologous genes，橫軸的節點數代表該基因出在的菌株個數，縱軸代表這一類的基因有共有多少個。根據結果可以看到約莫有兩千多個基因都有出現在各菌株中，但也有許多基因是只有單一菌株特有的基因。 37
Figure 14 利用序列比對找出未被註解的相似基因或是Gene Tree在建立個過程中，因為篩選條件太過於嚴格導致相似的基因未被歸類在一起，因此利用基因的序列，在其他菌株的基因體中找出具有相同序列當作是基因。 38
Figure 15 在TCDC上ABTW07_1704的基因序列可以對應到ATCC17978菌株中，但在ATCC17978菌株中缺少這一個基因的資料，表示有可能該基因在ATCC17978菌株中未被預測出來。 39
Figure 16經過序列比對後，可以找回在其他菌株有未註解的基因或是未被Gene Tree歸類為同一類的基因，每個node代表一株菌株，在序列比對完之後，可以看見有些基因其實也能在不同的菌株中找到。 40
Figure 17在基因總表中，在不同的菌株中找到相同的基因數共有4,613個基因而特有的基因共有982個，可以觀察到大部分的基因都存在於各菌株之間。 41
Figure 18比較不同毒性菌株的基因是否有存在差異之流程圖 42
Figure 19 利用長度覆蓋率決定參考序列的基因是否存在於未組裝的定序資料中。 44
Figure 20 在八個高毒性菌株中，共有的基因高達四千多個，而也有許多基因是在八個高毒性菌株中找不到的基因。 46
Figure 21在八個低毒性菌株中，共有的基因高達四千多個，而也有許多基因是在八個低毒性菌株中找不到的基因。 47
Figure 22 經由比較不同毒性菌株的基因後，篩選出約93個有差異的候選基因，有42個基因為hypothetical protein，有26個基因與噬菌體的蛋白質有關，只有25個基因具有完整的基因註解資訊。 49
Figure 23 在AYE菌株與2008P87菌株中，有比對到噬菌體序列存在。 52
Figure 24 在2008P87菌株中，註解有關噬菌體之基因列表，可以看出大部飯和噬菌體註解有關的基因都落在contig00022上。 53
Figure 25 將2008P87菌株的contig00022序列，利用NCBI資料庫搜尋可能的噬菌體物種，搜尋的結果較有可能為Pesudomonas phage phiCTX。 54
Figure 26 利用PHAST工具，預測在2008P87菌株中可能存在的噬菌體，結果找出有兩個噬菌體有可能存在於2008P87菌株，其中之一為Pesudomonas phage phiCTX。 55
Figure 27 2008P87菌株與AYE菌株噬菌體插入的區域基因排列相似，但因為2008P87菌株只有組裝成contigs，因此利用AYE菌株確認phiCTX插入的位置。 56
Figure 28 其他菌株如TCDC菌株與AYE菌株比較時，看不到有此噬菌體的序列。 56
Figure 29 在phiCTX插入區段的周圍，可以看到有已知的毒性因子LPS的存在。 57
Figure 30 自動化設計PCR引子對之流程。 60
Figure 31 利用比較的結果篩選出來的五個基因與另外兩個LPS相關基因，希望藉由PCR實驗可以在其他未定序的高毒性菌株群中檢測到。 62
Figure 32 在不同參考菌株中的候選基因，以multiple alignment的形式排列，可以比較出不同參考菌株中的變異點位置。 63
Figure 33利用multiple alignment的格式產生高度相似的序列，並標示出在不同的參考菌株中可能的變異位點，星號(*)所代表的是在不同參考菌株的基因中有變異點的位置。 64
Figure 34在定序資料排比至參考序列時，可以找出與參考序列不同的變異位點。 64
Figure 35 Primer3設計引子之結果範例，方框為Primer3所設計的引子對，此引子對有避開我們所標記的變異點位置(*)。 65
Figure 36設計出的PCR引子對，會利用序列比對的方式，確認PCR的結果只有單一產物，方框為引子黏合的位置。 66
Figure 37 針對候選基因設計出來的PCR引子對。 67
Figure 38 phiCTX的基因資訊。 70
Figure 39 在2008P87菌株與AYE菌株中，噬菌體可能插入的區域對應圖。2008P87菌株的contig00022序列中，噬菌體插入的位置剛好就是contig00022序列的後半段 71
Figure 40 在KEGG的紀錄中，主要合成LPS的反應路徑，深色為在A. baumannii菌株中有的基因，可以看到A. baumannii只有少部分的基因參與在LPS的合成反應路徑中。 74
表目錄
Table 1九十九年醫學中心加護病房醫療照護相關感染常見菌株前十名，擷取自中華民國疾病管制局統計表格。 2
Table 2九十九年區域醫院加護病房醫療照護相關感染常見菌株前十名，擷取自中華民國疾病管制局統計表格。 2
Table 3 2008P87與C918定序菌株的基因體資訊 19
Table 4 PGAAP基因預測結果與比較NCBI的菌株 32
Table 5各菌株中特有的基因個數 33
Table 6未組裝之定序資料對應到各參考菌株之覆蓋率。 43
Table 7覆蓋率大於70%的條件下，未組裝之定序資料具有參考菌株的基因比例。 45
Table 8覆蓋率大於80%的條件下，未組裝之定序資料具有參考菌株的基因比例。 45
Table 9覆蓋率大於90%的條件下，未組裝之定序資料具有參考菌株的基因比例。 45
Table 10 高低毒性菌株含有的基因個數表，High表示為高毒性菌株，Low表示為低毒性菌株，根據圖表可以看出大部分的基因都有存在於不同毒性菌株中。 46
Table 11 選取有可能具有差異的基因 48
Table 12 利用註解資訊搜尋，找到五個有關毒性因子的文獻 58
Table 13 將有差異的93個基因，對VFDB中收錄的毒性因子做搜尋，找到17已知的毒性因子。 59
Table 14 計算定序資料排比到在噬菌體插入的區域與周圍的長度覆蓋率。 72

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