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研究生:洪永聰
研究生(外文):Yong-Tsung Hong
論文名稱:運用Yarrowia lipolytica酵母菌胞外分泌系統執行富含促進生髮機能性胜肽之蛋白質開發與生產
論文名稱(外文):Development and Bioproduction of Protein Carrier Containing the Functional Peptide for Hair Germination in Yarrowia lipolytica
指導教授:簡宏堅簡宏堅引用關係
指導教授(外文):Hung-Chien Roger Chien
口試委員:林敦臺趙雲鵬
口試委員(外文):Duen-Tai-LinYun-Peng Chao
口試日期:2014-07-25
學位類別:碩士
校院名稱:大葉大學
系所名稱:分子生物科技學系碩士班
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2014
畢業學年度:102
語文別:中文
論文頁數:106
中文關鍵詞:生髮機能性胜肽人類酪胺酸羥基酵素
外文關鍵詞:Hair germination peptideprotein carrierhuman tyrosine hydroxylaseYarrowia lipolytica
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生髮機能性胜肽是由三種功能性胜肽搭配:Gly-His-Lys ( GHK ) 藉由促進毛髮根鞘的再生進而促進休止期,增強固定毛髮於真皮層,可以減緩落髮,提高毛囊的健康;Ala-His-Lys ( AHK )藉由細胞增殖和排除真皮乳突細胞凋亡的發生,產生刺激作用,促進人類的生長生成毛髮的毛囊;His-Gly-Gly ( HGG ) 可刺激毛髮生長。我們選用人類酪胺酸羥基酵素( Homo.sapiens tyrosine hydroxylase;HTH ) 做為攜帶機能性胜肽的蛋白擔體,再尋找此酵素構造的外圍胺基酸鏈時,發現有五大區段可做為置換機能性胜肽的位置,並且置換的區段是不影響活性中心,並在其機能性胜肽之N端與C端設計”Phe ”以利pepsin切割使胜肽釋出,確定其可行性後才進行生髮機能性胜肽之引子設計與構築。我們在完成酵素外圍含有生髮胜肽區段置換之後會將其轉殖於Yarrowia lipolytica中進行生產。首先將攜帶機能性胜肽蛋白HTH的第一區段、第二區段、第三四區段及第五區段,各置換入生髮機能性胜肽。完成單區段置換後,接著進行兩兩區段之連接;當連接完成後接著選殖進入Y. lipolytica酵母菌胞外分泌的表現載體pYLSC1-5S;最後將已置換好第一二三四五區段之生髮胜肽於 pYLSC1-5S內,再轉形插入至Y. lipolytica酵母菌染色體,完成生髮機能性胜肽之基因選殖。得到含有目標基因之酵母菌選殖株( Y-GHK-SC ) 並用分光光度計測定其生長曲線,得到最適生長時間為16小時;將Y-GHK-SC基因表現後得到粗酵素(crude GHK-HTH ),藉由人類酪胺酸羥基酵素自身之活性,運用高效能液相層析儀( HPLC )分析產物量反推酵素最大分泌量,測得誘導基因表現之酵素最大分泌量的時間為36小時,再用starch回收純化隨後進行分子量預測分析可知HTH是為54.6 kDa,而在基因選殖階段是置換機能性胜肽進入酵素中,故 GHK-HTH分子量是約54.6 kDa,而Y. lipolytica 酵母菌的轉譯後修飾導致目標蛋白醣基化,會使其分子量增加約10 kDa,故將純化後GHK-HTH進行SDS-PAGE分析分子量,結果約為65 kDa。經由多次的純化回收,發現1公升的培養液可以純化回收1037微克以上的胜肽蛋白。未來回收GHK–HTH胜肽蛋白,經由pepsin水解切割並釋出生髮胜肽,將其水解液利用LC-MS-MS分析,確認GHK-HTH的蛋白酶水解液中含有生髮胺胜肽基酸序列,而後將用 500L發酵槽生產GHK-HTH生髮胜肽蛋白,再將此生髮胜肽蛋白進行動物試驗及人體試驗,希望可以幫助人類治療禿頭,而後也將積極通過政府標章認證之健康產品。
Hair germination functional peptide is composed of three functional peptides. Gly-His-Lys (GHK) by promoting the regeneration of the hair root sheath thereby getting to the telogen and enhancing to fix hair in the dermis, can slow hair loss and improve the health of hair follicles. Ala-His-Lys (AHK) through stimulation of cell proliferation and apoptosis of dermal papilla cells, was promoting the growth of human hair follicles. His-Gly-Gly (HGG) can also stimulate hair growth. In order to establish the production of these three peptides with high-yield and high quantaty, the experiment was performed by using human tyrosine hydroxylase (HTH) carrying the 4 copies of functional peptides in the 5 surface domains of this enzyme without affecting its activity. Each peptide with both N-terminal and C-terminal of “Phe” was designed to facilitate future use of pepsin cutting in the digestion tract to release peptides. The gene completion of the replacement in five domains containing Hair germination peptide was cloned into the yeast expression vector pYLSC1-5s with the extracellular secretion and then transformed and integrated into Yarrowia lipolytica chromosome. Each surface domains carried one copies of peptide. Therefore, HTH totally carried 4 copies of functional peptides in the 5 domains without affecting its enzymatic activity. After completion of the replacement of each domains, the neighboring domains were connected. The completion of construct is followed by cloning into the Y. lipolytica yeast expression vector pYLSC1-5s with extracellular secretion, and then finally integrated into Y. lipolytica chromosome. The optimal growth of the yeast strain Y. lipolytica carring 4 copies of functional peptide was characterized as 16 hours in the growth curve with a spectrophotometer. The optimal secretion time of the peptide-carried protein was measured to be at 36 hour stimulation in the induction medium by HPLC. The peptide-carried protein was purified using starch binding technigue to homogenized and concentrated. Subsequent molecular analysis shows that the purified protein is about 65 kDa measured by SDS-PAGE analysis, because the post-translational modification in Y. lipolytica led to the glycosylation of target protein, and the molecular weight of target protein increased in 10 kDa. The correct molecular weight of parified protein is 54.6 kDa. The quantity of purified protein is 1,037 μg from one litter of yeast culture. The unit activity and the specific activity of purified protein was measured as 7.916×10-2 μmole / min and 3.814 U/mg, respectively. The amino acid sequence of hair germination peptide from the purified protein hydrolysed by pepsin will be analyzed by LC-MS-MS. Finally, the functional analysis of peptide-carried protein was performed in animal experiment and human trials. We hope that the peptides enchance Hair germination and then will be active through Government’s healthy food certification mark.
封面內頁
簽名頁
中文摘要 iii
英文摘要 v
誌謝 vii
目錄 viii
圖目錄 xii
表目錄 xvi

1. 前言 1
1.1 禿頭 1
1.2 生髮機能性胜肽 1
1.3 Y. lipolytica酵母菌胞外分泌系統 2
1.4 人類酪胺酸羫基酵素當作蛋白擔體 3
2. 研究動機 4
3. 材料與方法 6
3.1 材料 6
3.1.1 菌種及質體 6
3.1.2 藥品 6
3.1.3 酵素 6
3.2 實驗設計 7
3.2.1 引子設計 7
3.3實驗方法 8
3.3.1 快速質體DNA抽取套組 8
3.3.2 瓊脂凝膠電泳(agarose gel electrophoresis) 9
3.3.3 聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction) 9
3.3.4 重疊式聚合酶鏈鎖反應(Overlap polymerase chain reaction) 11
3.3.5 DNA片段的回收及純化 12
3.3.6 限制酵素剪切 12
3.3.7 DNA 黏接作用 13
3.3.8 E.coli 勝任細胞(competent cell)的製備 13
3.3.9 E.coli 的轉型作用 14
3.3.10 篩選式聚合酶鏈鎖反應 14
3.3.11 DNA定序 15
3.3.12 菌種保存 15
3.3.13 Y. lipolitica 的轉型作用 15
3.3.14 Y. lipolytica之生長曲線 16
3.3.15 Y. lipolytica之誘導曲線 17
3.3.16 蛋白質純化 18
3.3.17 聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析 18
4.結果 20
4.1 找尋 HTH中可置換生髮機能性胜肽之五大區段 20
4.1.1 五大區段之序列置換位置分析 20
4.1.2 不同種別之酪胺酸羫基酵素胺基酸序列比對 21
4.2 基因選殖 21
4.2.1 將生髮機能性胜肽序列置換至 HTH之第一
區段(GHK1) 22
4.2.2 將生髮機能性胜肽序列置換至 HTH之第二
區(GHK2) 22
4.2.3 將生髮機能性胜肽序列置換至 HTH 之第三
四區段(GHK34) 23
4.2.4 將生髮機能性胜肽序列置換至HTH之第五
區段 (GHK5) 23
4.2.5 接合生髮機能性胜肽序列第一區段及第二
區段 (GHK 1-2) 24
4.2.6 接合生髮機能性胜肽序列第三四區段及第
五區段(GHK 34-5) 24
4.2.7 接合生髮機能性胜肽第一、二區段及第三四
、五區段(GHK 12-345) 25
4.2.8 選殖生髮機能性胜肽GHK1-5於pYLSC1表
現載體(GHK-SC) 25
4.2.9 轉型生髮機能性胜肽GHK-SC於Y. lipolytica
酵母菌中(Y-GHK-SC) 26
4.3基因表現 26
4.3.1 Y. lipolytica 之生長曲線 26
4.3.2 Y. lipolytica 之誘導曲線 27
4.3.3 SDS-PAGE 之蛋白質分子量預測 27
4.3.4 表現、分泌、純化回收之蛋白量 28
5.結論 29
5.1 生髮機能性機能性胜肽 GHK利於人體皮膚吸收之可
行性 29
5.2 富含生髮機能性胜肽之蛋白質開發 29
5.3 未來工作 29
參考文獻 84

圖目錄

圖 1. 將三種胺基酸序列執行比對之結果 31
圖 2. 生髮機能性胜肽可置換之五大區段示意圖 32
圖 3. 可置換生髮機能性胜肽於 HTH 中之核苷酸五大區段
示意圖 33
圖 4. 更換表現載體之示意圖 34
圖 5. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第一區段,經重疊式
聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 35
圖 6. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第一區段,經篩選式
聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 36
圖 7. 將置換生髮機能性胜肽於 HTH 第一區段之陽性菌
抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 37
圖 8. 置換生髮機能性於 HTH 第一區段之比對 38
圖 9. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第二區段,經重疊式聚
合酶鏈鎖反應之膠體電泳 39
圖10. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第二區段,經篩選式
聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 40
圖11. 將置換生髮機能性胜肽於 HTH 第二區段之陽性菌
抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 41
圖12. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第二區段之比對 42
圖13. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第三、四區段,經重
疊式聚合酶鏈鎖反應之膠體電 43
圖14. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第三、四區段,經篩
選式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 44
圖15. 將置換生髮機能性胜肽於 HTH 第三、四區段之陽
性菌抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 45
圖16. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第三、四區段之比對 46
圖17. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第五區段,經重疊式
聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 47
圖18. 置換生髮機能性胜肽於 HTH 第五區段,經篩選式
聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 48
圖19. 將置換生髮機能性胜肽於 HTH 第五區段之陽性菌
抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 49
圖20. 換生髮機能性胜肽於 HTH 第五區段之比對 50
圖21. 接合生髮機能性胜肽第一區段及第二區段於 HTH中,
經重疊式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 51
圖22. 接合生髮機能性胜肽第一區段及第二區段於 HTH中,
經篩選式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 52
圖23. 將接合生髮機能性胜肽第一區段及第二區段於HTH 中
之陽性菌抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 53
圖24. 接合生髮機能性胜肽第一區段及第二區段於 HTH中之
比對 54
圖25. 接合生髮機能性胜肽第三四區段及第五區段於 HTH中
,經重疊式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 55
圖26. 接合生髮機能性胜肽第三四區段及第五區段於 HTH
中,經篩選式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 56
圖27. 將接合生髮機能性胜肽第三四區段及第五區段於HTH
中之陽性菌抽出質體後,進行限制酶切割之膠體電泳 57
圖28. 接合生髮機能性胜肽第三四區段及第五區段於 HTH中
之比對 58
圖29. 接合生髮機能性胜肽第一二區段及第三四五區段於
HTH中,經重疊式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 59
圖30. 接合生髮機能性胜肽第一二區段及第三四五區段於
HTH中,經篩選式聚合酶鏈鎖反應之膠體電泳 60
圖31. 將接合生髮機能性胜肽第一二區段及第三四五區段於
HTH中之陽性菌抽出質體後,進行限制酶切割之膠
體電泳 61
圖32. 接合生髮機能性胜肽第一二區段及第三四五區段於
HTH中之比對 62
圖33. 經聚合酶鏈鎖反應後由試劑套組將目標片段純化後之
膠體電泳 64
圖34. 目標基因更換表現載體後,經篩選式聚合酶鏈鎖反應
之膠體電泳 65
圖35. 目標基因更換表現載體之陽性菌抽出質體後,進行限
制酶切割之膠體電泳 66
圖36. 目標基因更換表現載體示意圖 67
圖37. 目標基因更換表現載體,經基因選殖後抽取質體並經
限制酵素 (Hpa I) 切割之膠體電泳 68
圖38. 目標基因更換表現載體,經篩選式聚合酶鏈鎖反應之
膠體電泳 69
圖39. Y. lipolitica之生長曲線 70
圖40. 用高效液相層析儀分析 24 mM tyrosine 20 μl標準品
之滯留時間 71
圖41. 使用高效液相層析儀分析 24 mM L-DOPA 20 μl標準品
之滯留時間 72
圖42. 使用高效液相層析儀分析不同時間取樣之粗酵素催化
受質生合成產物之滯留時間 73
圖43. 富含生髮胜肽(GHK-TyrOH)之誘導分泌量曲線圖 74
圖44. 目標基因表現經Starch純化於聚丙烯酰胺凝膠電泳後
之結果 75
圖45. 利用Bio-Rad assay製出BSA標準區線定量蛋白質 76
圖46. 載體 PQE30 之圖譜 77
圖47. 載體 pYLSC1 之圖譜 78


表目錄

表1. 菌種與質體 79
表2. Y. lipolytica 酵母菌胺基酸編碼使用頻率 81
表3. primer design 82


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