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研究生:沈蔚婷
研究生(外文):SHEN,WEI-TING
論文名稱:α-晶體蛋白的安定性研究
論文名稱(外文):The stability of the α-crystallin
指導教授:李惠珍李惠珍引用關係
指導教授(外文):LEE,HWEI-JEN
口試委員:周慰遠黃啟清周記源
口試委員(外文):CHOU,WEI-YUANHUANG,CHI-CHINCHOU,JI-YUAN
口試日期:2014-05-26
學位類別:碩士
校院名稱:國防醫學院
系所名稱:生物化學研究所
學門:生命科學學門
學類:生物化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2014
畢業學年度:102
語文別:中文
論文頁數:75
中文關鍵詞:α-晶體蛋白
外文關鍵詞:α-crystallin
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α-晶體蛋白為脊椎生物水晶體中之蛋白質,屬於小熱休克蛋白家族。由 αA 和 αB 兩個 subunit 組成,序列相似性約 57%,每個單體分子量約 20 KDa,以高分子量的異質多聚體的方式存在。本研究想探討於 37℃不同時間反應下,αA 和αB-晶體蛋白之同質及不同比例之異質聚體之結構變化、熱安定性,分子大小及對其基質蛋白精胺醯丁二酸裂解酶 chaperone 活性變化等研究。以 ANS 螢光分析不同比例異質聚體的疏水性區域暴露比 αB-晶體蛋白同質聚體小 29%;與αA-晶體蛋白同質聚體則無明顯差異。在熱安定性實驗中發現不同比例1:3、3:1 及 1:1 異質聚體其 Tm 值各約 83.5℃、91.6℃及 92.6℃會介於 αB-晶體蛋白同質聚體 70.8℃與 αA-晶體蛋白同質聚體 92.8℃之間。由 CD 光譜分析二級結構變化,發現異質聚體的二級結構和αA-晶體蛋白同質聚體相對 α-helix 比例上升 4%,β-sheeet 比例下降 6%;而和αB-晶體蛋白同質聚體α-helix 比例上升 4%,β-sheeet 比例下降4%。3:1 比例之異質聚體對於精胺醯丁二酸裂解酶熱變性的保護率為90%,相對其他比例 1:1 及 1:3 保護率 84%及 74%之保護效果較好;αA-晶體蛋白同質聚體對於精胺醯丁二酸裂解酶熱變性的保護率為92.3%相對於αB-晶體蛋白同質聚體 34.5%好。分析αA 和αB-晶體蛋白其同質聚體及不同比例之異質聚體於不同冷凍和回溫速率下安定性,條件為:固定冷凍速率在60℃/min 及回溫速率在 60℃/min 及 1℃/min、固定冷凍速率在 1℃/min 及回溫速率在 60℃/min 及 1℃/min 。發現 αB-晶體蛋白其同質聚體及不同比例混合形成之異質聚體於反應 24 小時後之冷凍安定性比 37℃反應 2 小時安定,蛋白質濃度損失程度相對較低。慢速回溫和冷凍會對蛋白質造成破壞,α-晶體蛋白同質聚體冷凍處理後相對未處理濃度百分比為 81.3%。以冷凍速率 1℃/min 及回溫速率60℃/min,αA 與αB 晶體蛋白其同質聚體及1:1、1:3、1:7、3:1 及 7:1 不同比例異質聚體冷凍處理後相對未處理濃度百分比依序為:79.8%、88.4%、96.5%、88.2%、97.9%、91.2%、93.5%,顯示αA 與αB 晶體蛋白同質聚體冷凍安定性比不同比例異質聚體較差。接著要探討於 37℃不同時間反應後,以冷凍速率 1℃/min 及回溫速率 1℃/min處理,αA 和αB-晶體蛋白之同質及比例1:1下異質聚體之結構變化、分子大小及對其基質蛋白精胺醯丁二酸裂解酶 chaperone 活性變化皆與未冷凍處理之結果相似。

The lenticular α-crystallin consisits of two 20-kDa polypeptide chains, αA andαB, which belongs to the small heat shock protein family. They have 57% sequence homology among themselves. In this study, the change in structure, chaperone activity, complex size and thermostability of αA and αB- homooligomer and their heterooligomer in different ratio incubated at 37℃ were investigated. The result showed that heterooligomer of αA and αB-crystallin have about 29% smaller than αB-homooligomer in exposed hydrophobic region as measured by ANS binding. Thermalstability analysis showed the Tm values of heterooligomer in the ratio of 1:3,3:1 and 1:1 were about 83.5℃,91.6℃ and 92.6℃,respectively which were between the Tm values of αA and αB-homooligomer, 70.8℃ and 92.8℃ respectively.The CD data showed about 4% increased and 6% decreased in α-helix and β-sheet content respectively,as comparing the heterooligomer in ratio of 3:1 with αA-crystallin homooligomer and showed about 4% increased and 4% decreased in the contents as compared with αB-homooligomer.The heterooligomer in ratio of 3:1,1:1 and 1:3 showed about 90%, 84% and 74%,respectively,protection of hASL from thermodenaturation. The protection ability of αA-crystallin homooligomer was about 92.3% higher than the αB- homooligomer(34.5%).The heterooligomer that incubated for 24h then through freezing-thawing cycle showed higher stability than that incubated for 2 hours.The results showed that slow freezing and thawing rate induces damage in protein stability.The protein concentration remained after freez-thaw forαA and αB- homooligomer and heteroligomer in ratio of 1:1,1:3,1:7,3:1and 7:1 were 79.8%、88.4%、96.5%、88.2%、97.9%、91.2% and 93.5%,respectively.The heterooligomer showed a better stability than αA and αB- homooligomer.


總目錄


總目錄 ………………………………………………… I
目錄 ………………………………………………… II
表目錄 ………………………………………………… IV
圖目錄 ………………………………………………… V
附錄目錄 ………………………………………………… VIII
名詞縮寫對照表………………………………………………… IX
中文摘要 ………………………………………………… X
英文摘要 ………………………………………………… XII



目 錄

緒論 ……………………………………………………………… 1
實驗材料
壹、藥品試劑…………………………………………………… 5
貳、儀器及材料………………………………………………… 6
参、試劑配製…………………………………………………… 7
實驗方法
壹、勝任細胞(E. coli DH5α及 BL21)製作……………11
貳、轉形作用(Transformation)…………………………11
参、野生型蛋白質之菌體培養……………………………… 12
肆、野生型之蛋白質純化…………………………………… 13
伍、測定蛋白質濃度………………………………………… 16
陸、圓偏振二色旋光光譜儀之蛋白質二級結構分析……… 17
柒、ANS 螢光實驗…………………………………………… 18
捌、於固定溫度下測定個別αA晶體蛋白和個別αB晶體蛋
白或是兩者混合後對於蛋白質聚集的保護作用………… 19
玖、冷凍處理後對蛋白質濃度的影響……………………… 20
拾、Nativa-PAGE……………………………………………… 21
拾壹、Isoelectric focusing…………………………………… 21
實驗結果
壹、蛋白質純化………………………………………………… 23
貳、αA與αB晶體蛋白同質聚體以及兩者比例 1:1 異質
聚體於37℃混合 0、2、24 小時的 Native-PAGE………24
参、αA與αB晶體蛋白同質聚體以及兩者比例 1:1 異質
聚體於37℃混合 0、2、24 小時的 IEF-PAGE……………24
肆、αA或αB晶體蛋白同質聚體以及不同比例混合異質聚體的ANS 結合螢光光譜分析………………………24
伍、不同α晶體蛋白加熱影響下安定性分析………………… 25
陸、溫度效應下各別αA或αB晶體蛋白以及兩者不同比例
混合後蛋白質的圓偏振二色旋光譜分析…………………26
柒、αA或αB晶體蛋白同質聚體以及不同比例混合異質聚體的ANS 結合螢光光譜分析…………27
捌、不同冷凍速率影響單獨αA or αB晶體蛋白或不同比例
混合incubate α-晶體蛋白濃度變化…………………………28
討論…………………………………………………………… 67
參考文獻 …………………………………………………………73

表目錄

表一、野生型αA 與αB晶體蛋白溫度影響與 ANS 結合後螢光光譜
分析………………………………………………………………32
表二、單獨αA及αB晶體蛋白或兩者不同比例混合後經 37℃ 作
用效應下的二級結構分析………………………………………33
表三、單獨αA及αB晶體蛋白或兩者以比例1:1混合後經37℃作
用效應下再經冷凍處理後的二級結構分析……………………34
表四、熱效應影響下蛋白質變性形成及反應之Tm值 ……………… 35
表五、不同比例下αA與αB晶體蛋白於37℃ incubate 0、2、24小
時下,對hASL受熱變性的保護作用…………………………36
表六、αA與αB晶體蛋白在37℃相同incubate時間,不同比例下
對hASL的熱效應變性的保護作用……………………………37
表七、溫度效應下單獨αA與αB晶體蛋白對人類精胺醯丁二酸裂
解酶受熱變性的保護作用……………………………………38
表八、αA與αB晶體蛋白以比例1:1混合後在溫度效應下經冷凍處
理後對人類精胺醯丁二酸裂解酶受熱變性的保護作用………39

圖目錄

圖一、 野生型αA晶體蛋白、野生型αB晶體蛋白與野生型人類精胺醯丁二酸裂解酶純化……………………………………44
圖二、 各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 1:1 比例混合於37℃下 incubate 0 、2 及 24 小時後進行 Native- PAGE …… 45
圖三、 各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 1:1 比例混合於37℃下 incubate 0 、2 及 24 小時後進行 IEF- PAGE………45
圖四、 各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 1:3 比例混合於
37℃下 incubate 0、2及24小時後與 ANS 結合後之螢光光譜……………………………………………………………46
圖五、 各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 1:1 比例混合於
37 ℃下 incubate 0 、2 及 24 小時後與 ANS 結合後之螢光光譜…………………………………………………………… 47
圖六、各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 1:1 比例混合於 37
℃下incubate 0、2 及 24 小時後再以冷凍速率1℃/min,回溫速率1℃/min處理後與ANS結合後之螢光光譜………… 48
圖七、各別野生型αA及αB晶體蛋白或兩者以 3:1 比例混合於
37℃下incubate 0 、2 及 24 小時後與 ANS 結合後之螢光光譜…………………………………………………………………49
圖八、熱效應下(固定溫度上升速度,1℃/min),各別αA晶體蛋
白、αB晶體蛋白或兩者在比例αA: αB=1:3 於 37℃下incubate 0、2、24 小時後的可見光散射情形………………… 50
圖九、熱效應下(固定溫度上升速度,1℃/min),各別αA晶體蛋
白、αB晶體蛋白或兩者在比例αA: αB=1:1 於 37℃下Incubate 0 、2、24小時後的可見光散射情形……………… 51
圖十、 熱效應下(固定溫度上升速度,1℃/min),各別αA晶體蛋
白、αB晶體蛋白或兩者在比例αA: αB = 3:1 於 37℃下incubate 0、2、24小時後可見光散射情形………………… 52
圖十一、 各別αA晶體蛋白、αB晶體蛋白或兩者在比例α
A: αB=1:3於37℃下 incubate 0 、2、24 小時後的圓偏振二色旋光光譜分析……………………………………………53
圖十二、各別αA晶體蛋白、αB晶體蛋白或兩者在比例α
A:αB=1:1於 37℃下 incubate 0 、2、24 小時後的圓偏振二色旋光光譜分析……………………………………………… 54
圖十三、各別αA晶體蛋白、αB晶體蛋白或兩者在比例αA:α
B=1:1於 37℃下 incubate 0 、2、24 小時後再以冷凍速率1℃/min。回溫速率 1℃/min 處理的圓偏振二色旋光光譜分
析………………………………………………………………55
圖十四、各別αA晶體蛋白、αB晶體蛋白或兩者在比例αA:α
B=3:1於 37℃下 incubate 0 、2、24 小時後的圓偏振二色旋光光譜分析……………………………………………… 56
圖十五、溫度效應下單獨αA 晶體蛋白對人類精胺醯丁二酸裂解酶受熱變性的保護作用……………………………………… 57
圖十六、溫度效應下單獨αB 晶體蛋白對人類精胺醯丁二酸裂解受熱變性的保護作用………………………………………… 58
圖十七、單獨αA 和αB晶體蛋白以及五種比例混合後經 37℃incubate 0、2、24 小時後蛋白質的濃度變化…………… 59
圖十八、單獨αA 和αB晶體蛋白以及五種比例混合後經 37℃
incubate 0、2、24 小時後再以冷凍速率 1℃/min,回溫速率60℃/min 處理後的蛋白質濃度變化……………………… 60
圖十九、單獨αA 和αB晶體蛋白以及五種比例混合後經 37℃
incubate 0、2、24 小時後再以冷凍速率 60℃/min,回溫速率 60℃/min 處理後的蛋白質濃度變化………………… 61
圖二十、 單獨αA 和αB晶體蛋白以及五種比例混合後經 37℃
incubate 0、2、24 小時後再以冷凍速率 60℃/min,回溫速率1℃/min 處理後的蛋白質濃度變化…………………… 62
圖二十一、 單獨αA 和αB晶體蛋白以及五種比例混合後經 37℃
incubate 0、2、24 小時後再以冷凍速率 1℃/min,回溫速率 1℃/min 處理後的蛋白質濃度變化………………… 63
圖二十二、單獨αA 和αB晶體蛋白以及比例1:1混合後經 37℃
incubate 0、2、24 小時後再以冷凍速率 1℃/min,回溫速率 1℃/min 處理後的Native-PAGE…………………… 64
圖二十三、 冷凍回溫速率改變冰晶形狀也不同…………………… 66


附錄目錄
附錄一、humanαA andαB -crystallin amino acid sequences………… 70
附錄二、αB-crystallin 的模擬結構比較……………………………… 71
附錄三、形成 protein aggregation 的兩種路徑……………………… 72
































參考文獻

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