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研究生:潘俊琛
研究生(外文):Pan, Chun-Chen
論文名稱:紫紅硬孔菌多功能木質素過氧化酶之基因選殖及蛋白質表現
論文名稱(外文):Cloning and expression of versatile peroxidase from Rigidoporus vinctus
指導教授:林棋財
指導教授(外文):Lin, Chi-Tsai
口試委員:李平篤許垤棋陳玉婷
口試日期:2014-07-09
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣海洋大學
系所名稱:生物科技研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2014
畢業學年度:102
語文別:中文
論文頁數:46
中文關鍵詞:木質素多功能木質素過氧化酶
外文關鍵詞:ligninversatile peroxidase
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多功能木質素過氧化酶 (versatile peroxidase ; VP ) 為白腐真菌所分泌並參與自然界中之木質素分解。此酵素可藉催化活性位之色胺酸或經其 heme基團氧化後之Mn3+,將多種芳香族化合物氧化分解,這種木質素分解酵素可應用於紙漿漂白、染料廢水處理及芳香類汙染物之降解等用途。
本實驗比對不同物種之木質素過氧化酶序列,從紫紅硬孔菌 (Rigidoporus vinctus) 中選殖出木質素過氧化酶之 cDNA 序列,其蛋白質轉譯區含1074個鹼基對,可轉譯出357個胺基酸,經序列比對可確認為多功能木質素過氧化酶。其預測分子量為34 kDa。利用杏鮑菇 (Pleurotus eryngii) 之多功能木質素過氧化酶 (PDB ID: 2VKA) 為模版,模擬蛋白3-D結構,同時辨識多功能木質素過氧化酶所含之兩個催化活性位,其功能分別可氧化錳離子和氧化芳香族化合物。
將 R. vinctus 之 VP 基因片段接合至表現載體pET20b(+) 和 pYEX-S1,接著分別轉形至 Escherichia coli 及 Saccharomyces cerevisiae。以 E. coli 表現重組蛋白RvVP時會形成不可溶之包涵體,而以 S. cerevisiae 表現RvVP時則可得到可溶性蛋白,但可溶性之RvVP並未偵測到催化活性,推估可能為重組蛋白缺乏 heme 基團所導致。

Versatile peroxidase secreted by the white-rot fungus involved in the natural degradation of lignin. Versatile peroxidase can oxidize a variety of aromatic compounds by the catalytic tryptophan residue or Mn3+ which oxidized at the haem channel site. This lignin-degrading enzymes have potential applications in the pulp biobleaching, textile dyes decolorization, aromatic pollutants decomposition.
In this study, a cDNA (1074 bp) encoding a putative VP from Rigidoporus vinctus was identified based on sequence homology. The deduced amino acid sequence (357 amino acids) is conseRved among the reported VP. The predicted molecular weight of RvVP was 34.8 kDa. A 3-D structural model of RvVP was constructed based on the crystal structure of Pleurotus eryngii VP (PDB code 2VKA). The active sites for oxidation of Mn2+ ions and for oxidation of aromatic substrates were identified, both characteristic for versatile peroxidase.
To characterize the RvVP, the coding region was subcloned into an expression vector pET-20b(+) and pYEX-S1, then transformed into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. The recombinant RvVP expressed as inclusion bodies in E. coli and the soluble recombinant RvVP was obtained in S. cerevisiae, but the catalytically inactive this might be ascribable to absence of heme group.

摘要 ii
Abstract iii
縮寫表 iv
目錄 v
壹、 前言 1
一、Rigidoporus vinctus 1
二、木質素 1
三、Versatile peroxidase 1
(一) VP來源 1
(二) VP蛋白質特性 2
(三) VP反應機制 2
(四) VP應用 2
(五) 研究動機 2
貳、實驗材料 3
一、真菌、質體及微生物材料 3
(一) 物種: 3
(二) 載體: 3
(三) 宿主: 3
二、培養基 4
三、套組 4
四、標準品 4
五、儀器設備 4
六、實驗藥品 5
(一) 酵素 5
(二) 緩衝液 5
(三) 培養基添加物 5
(四) 染劑 5
(五) 蛋白質電泳及純化相關藥品 6
(六) 活性測試相關藥品 6
(七) 其他 6
七、實驗耗材 6
八、引子 7
參、實驗方法 8
一、RvVP基因選殖 8
(一) 片段選殖 8
(二) DNA電泳分析方法 8
(三) 目標DNA純化 9
(四) 目標DNA選殖載體之建構與序列確認 9
(五) RvVP全長序列 9
二、RvVP之蛋白質表現 10
(一) 表現載體之構築 10
1. 大腸桿菌表現載體 10
2. 酵母菌表現載體 11
(二) 重組表現質體之轉形作用 11
1.大腸桿菌勝任細胞之製備 11
2.大腸桿菌之轉形作用 11
3. S. cerevisiae之轉形作用 12
4. Y. lipolytica之轉形作用 12
(三) RvVP蛋白質誘導表現、純化及電泳分析 12
1. RvVP於大腸桿菌之誘導表現 12
2. RvVP於酵母菌之誘導表現 12
3. 親和性管柱層析 13
4. 聚丙烯醯胺電泳分析 13
(四)RvVP純化後之透析 14
三、RvVP之特性分析 14
(一) 蛋白質的濃度測定 14
(二) 酵素活性測定 14
1. Trp165之催化活性 15
2. Heme 基催化通道之活性 15
肆、結果 16
一、RvVP之基因選殖 16
(一) 5' RACE 與 3' RACE RvVP cDNA選殖 16
(二) RvVP全長 16
(三) 生物資訊分析 16
(四) 3-D結構模擬 16
三、RvVP之表現與純化 17
(一) 建構表現載體 17
(二) RvVP 的誘導表現及純化 17
1. 大腸桿菌之表現與純化 17
2. 酵母菌之表現與純化 17
伍、討論 19
陸、參考文獻 21
圖表 23
Appendix 35


郭家瑜,2012, Rigidoporus vinctus 漆氧化酶之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析,國立臺灣海洋大學生物科技研究所 碩士學位論文

蔡薇薇, 2012, 樟芝2,3-丁二醇之基因選殖、蛋白質表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學生物科技研究所 碩士學位論文

張哲綺, 2012, 牛樟芝芳基醇脫氫酶之基因選殖、表現及酵素特性分析, 國立臺灣海洋大學生物科技研究所 碩士學位論文

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