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研究生:楊哲瑜
研究生(外文):Che-Yu Yang
論文名稱:不同型式發酵槽深層培養白樺茸菌Inonotus obliquus生產胞外多醣體之研究
論文名稱(外文):Production of Exopolysaccharide from Submerged Culture of Inonotus obliquus Using Different Types of Fermentors
指導教授:閻立平閻立平引用關係
指導教授(外文):Lipyng Yan
口試委員:顏文義林聖敦
口試委員(外文):Yan,Wen-YiSheng-Dun Lin
口試日期:2014-07-04
學位類別:碩士
校院名稱:東海大學
系所名稱:食品科學系
學門:農業科學學門
學類:食品科學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2014
畢業學年度:102
語文別:中文
論文頁數:170
中文關鍵詞:白樺茸胞外多醣體深層培養抗氧化力
外文關鍵詞:Inonotus obliquusexopolysaccharidesubmerged cultureantioxidative activityfermentor
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白樺茸菌(Inonotus obliquus)為一種珍貴的食藥用菇類,早期被用於治療許多疾病,例如癌症、心臟疾病及糖尿病等,近幾年研究顯示其多醣體為白樺茸之主要的生物活性成分。目前市場上已開發出多種白樺茸之相關產品,因此本實驗選用白樺茸為試驗菌種,探討深層培養條件及不同型式發酵槽對其胞外多醣體生成與發酵液之生物活性(抗氧化力、多醣體分子量及β-(1→3)-D-glucan相對含量)影響。實驗結果顯示,白樺茸菌於平板培養基(基礎培養基)及30℃之生長速率(0.32 cm/day)較快,最適胞外多醣生成之深層培養條件為:碳源為1%(w/v)之glucose、氮源為1%(w/v)之peptone、生長因子為0.3%(w/v)之corn steep liquor、無機鹽類為0.1%(w/v)之MgSO4.7H2O、培養液起始pH 8.0及接菌量為10%(v/v);以上述最適條件之搖瓶培養可於培養第10天同時達到最高菌絲體及胞外多醣體產量(分別為6.28 g/l及191.57 mg/l),而分別為基礎培養基最高產量(3.74 g/l及101.63 mg/l )之1.68及1.88倍。發酵參數顯示搖瓶組具有最高之菌絲體生成量(6.28 g/l)及菌絲體生成速率(Qx = 0.63 g/l/day);而最高胞外多醣產量(Pmax)及最高菌絲體產量(Xmax)呈現氣舉式>攪拌式>氣泡式組之趨勢。搖瓶培養及三種不同發酵槽組所得之胞外多醣體分子量範圍為15.96~25.7(×104 Da)。發酵液萃取物之抗氧化性測試中,除了DPPH自由基清除能力以氣舉式發酵液乙醇萃取組最佳(IC50 = 5.43 g/l)外,其它在總抗氧化力、螯合亞鐵離子能力及還原力三種抗氧化力測試中,亦以氣舉式發酵液熱水萃取組最佳,其IC50分別為2.41、5.98及14.36(g/l)。胞外多醣中β-(1→3)-D-glucan之相對含量則以氣舉式發酵槽組最高(48.03 μg/ml LE)。綜上所述,以胞外多醣產量、胞外多醣產率、菌絲體產率、發酵液萃取物之抗氧化力及胞外多醣體中β-(1→3)-D-glucan相對含量而言,皆以氣舉式發酵槽組為較佳。因此,以具較低剪切力、較佳對流循環及較低熱破壞之氣舉式發酵槽培養,會較氣泡式或攪拌式發酵槽能有更高產量及較佳機能性之白樺茸菌胞外多醣體。
Inonotus obliquus is a kind of mushroom which has long been used as a folk remedy for curing various diseases such as cancers, heart disease and diabetes in Russian and Eastern Europe. Exopolysaccharides (EPS) are one of the main bioactive constituents of I. obliquus with health functions and many kinds of EPS-related health supplements have been developed in the market. A EPS-producing I. obliquus, was selected in this research to study the effect of submerged culturing condition and different types of fermentors on the production and bioactivity (antioxidative activities, molecular weights and β-(1→3)-D-glucan content) of EPS by this strain.Results showed that Inonotus obliquus had a mycelial growth rate of 0.32 cm/day on basal medium agar at 30℃. Factors for optimal submerged-culturing condition were : glucose at 1% (w/v), peptone at 1% (w/v), corn steep liquor at 0.3% (w/v), MgSO4.7H2O at 0.1% (w/v) , initial pH of 8.0 and inoculum of 10% (v/v). Under this optimized culturing condition, maximal yields of mycelial biomass (6.28 g/l) and EPS (191.57 mg/l) were reached on the 10th day of incubation from shake flask culture and increased 1.68 and 1.88 times, respectively, as compared with those (3.74 g/l and 101.63 mg/l) of the basal medium.The highest biomass yield (Xmax=6.28 g/l) and biomass formation rate (Qx=0.63 g/l/day) were observed from shake flask culture. Among the three types of fermentors, both maximal exopolysaccharide yield (Pmax) and maximal biomass yield (Xmax) showed an increasing tendency of air lift fermentor > stirred-tank fermentor > bubble column fermentor.The molecular weight of exopolysaccharides from shake flask and three types of fermentors ranged from 15.96 to 25.7 (×104 Da) .The hot-water extracts of fermented culture from air lift fermentor shwed the highest total antioxidant capacity (IC50=2.41 g/l), ferrous-ion chelating ability (IC50=5.98 g/l) and reducing power (IC50=14.36 g/l) among all extracts from three types of fermentors. The highest DPPH.scavenging effect (IC50=5.43 g/l) was found in ethanolic extract of fermented culture from air lift fermentor.The EPS from air lift fermentor had the highest relative β-(1→3)-D-glucan content among those from three types of fermentors.As mentioned above, using air lift fermentor, which has lower shearing force, better circulating effect and lower temperature injury as compared with stirred-tank and bubble column fermentors, could produce higher yield of EPS from Inonotus obliquus with better bioactivity.

摘要……XIV
Abstract……XVI
壹、前 言……1
貳、文獻回顧……3
一、白樺茸(Inonotus obliquus)簡介……3
(一)白樺茸菌之分類、命名及分佈……3
(二)白樺茸菌生態習性……4
(三)白樺茸菌化學組成與相關之保健功能研究……6
(四)白樺茸菌之藥用開發與展望……12
二、食藥用菇類多醣簡介……13
(一)多醣體之結構……13
(二)β-D-glucan之免疫活性……16
三、 食藥用菇類之深層培養……18
(一)深層培養之定義……18
(二)深層培養與傳統固態培養之差異……18
(三)影響深層培養的因素……21
(四)深層發酵之應用……24
參、材料與方法……31
一、試驗材料……31
(一)試驗菌種……31
(二)培養基……31
(三)重要藥品……33
二、試驗儀器……34
三、試驗方法……36
(一)試驗流程……36
(二)菌種貯存……37
(三)菌種活化……37
(四)種菌培養……37
(五)種菌懸浮液之製作……37
(六)平板培養基試驗……38
(七)搖瓶試驗……38
(八)發酵槽試驗……39
四、分析方法……41
(一)菌絲體乾重測定……41
(二)pH值之測定……41
(三)胞外多醣之測定……41
(四)殘糖分析……42
(五)發酵參數之分析……42
(六)分子量之測定……44
(七)熱水及乙醇萃取物製備……45
(八)抗氧化力之測定……45
(九)β-(1→3)-D-glucan相對含量測定……50
(十)統計分析……51
肆、結果與討論……52
一、平板培養基試驗……52
(一)培養溫度及不同培養基對白樺茸菌絲體生成之影響……52
二、搖瓶試驗……59
(一)碳源對白樺茸菌胞外多醣生成之影響……59
(二)氮源對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……61
(三)生長因子對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……63
(四)無機鹽類對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……65
(五)培養基起始pH值對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……67
(六)培養基不同接菌量對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……69
(七)搖瓶培養時間對白樺茸菌胞外多醣體生成之影響……71
三、不同型式發酵槽培養試驗……74
(一)胞外多醣體生成之影響……74
(二)多醣體分子量之測定……83
四、 發酵液抗氧化力之測定……88
(一)DPPH自由基清除能力測定……89
(二)總抗氧化能力測定……93
(三)螯合亞鐵離子能力測定……97
(四)還原力測定……101
五、β-(1→3)-D-glucan相對含量測定……106
伍、結論……108
陸、參考文獻……111
柒、附錄……122

表目錄
表一 白樺茸菌的碳水化合物組成……7
表二 食用藥菇類不同培養方式之比較……20
表三 不同型式發酵槽之優缺點比較……25
表四 不同培養溫度及培養基對白樺茸菌於平板培養基上(培養20天)菌絲生長之影響……56
表五 不同培養溫度及培養基對白樺茸菌於平板培養基上(培養20天)菌絲生長速率之影響……57
表六 碳源對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……60
表七 氮源對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……62
表八 生長因子對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……64
表九 無機鹽類對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……66
表十 起始PH值(4~8)對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……68
表十一 接菌量(5~20%)對搖瓶培養之白樺茸菌菌絲體及胞外多醣體產量之影響……70
表十二 白樺茸菌於搖瓶試驗及不同發酵槽培養時之發酵參數……81
表十三 膠體滲透層析法不同分子量多醣標準品(Α-D-葡聚糖)之滯留時間……85
表十四 膠體滲透層析法測定四種不同發酵液之胞外多醣體分子量……86
表十五 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇及熱水萃取物之清除DPPH自由基之IC50……92
表十六 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇及熱水萃取物之總抗氧化力之IC50……96
表十七 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇及熱水萃取物之螯合亞鐵離子能力之IC50……100
表十八 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵發酵液粉末乙醇及熱水萃取物之還原力之IC50……105
表十九 四種不同形式發酵液中胞外多醣之β-(1→3)-D-glucan相對含量……107


圖目錄
圖一 白樺茸菌之外觀形態。……5
圖二 六種白樺茸菌的化合物結構。……8
圖三 具抗腫瘤活性的β-(1→6)分支β-(1→3)-D-葡聚醣結構。……14
圖四 X射線衍射測定之β-(1→3)-D-葡聚醣結晶結構。……15
圖五 香菇多醣lentinan對寄主所產生的免疫反應。……17
圖六 不同型式發酵槽之構造(a)攪拌式,(b)氣泡式,(c)氣舉式。……28
圖七 白樺茸於不同平板培養基之菌絲生長情形(30℃/10天)。……53
圖八 白樺茸菌於20、25、30及35℃培養溫度下之菌絲外觀。……54
圖九 不同溫度培養期間對白樺茸菌於基礎培養基上菌絲生長情形……58
圖十 搖瓶培養期間胞外多醣、菌絲體、PH值及殘糖量之變化。……73
圖十一 攪拌式發酵槽培養期間白樺茸菌胞外多醣、菌絲體、PH值及殘糖量之變化。……75
圖十二 氣泡式發酵槽培養期間白樺茸菌胞外多醣、菌絲體、PH值、殘糖量及溶氧量之變化。……76
圖十三 氣舉式發酵槽培養期間白樺茸菌胞外多醣、菌絲體、PH值及殘糖量之變化。……77
圖十四 三種發酵槽中白樺茸菌絲形成之外觀。……80
圖十五 搖瓶試驗與三種不同型式發酵槽白樺茸菌胞外多醣體分子量圖譜。……87
圖十六 搖瓶及三種不同型式發酵槽白樺茸菌發酵液粉末乙醇萃取物之DPPH自由基清除能力。……90
圖十七 搖瓶及三種不同型式發酵槽白樺茸菌發酵液粉末熱水萃取物之DPPH自由基清除能力。……91
圖十八 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇萃取物之總抗氧化能力。……94
圖十九 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末熱水萃取物之總抗氧化能力。……95
圖二十 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇萃取物之螯合亞鐵離子能力。……98
圖二十一 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末熱水萃取物之螯合亞鐵離子能……99
圖二十二 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末乙醇萃取物之還原力。……103
圖二十三 搖瓶及三種不同型式發酵槽之白樺茸菌發酵液粉末熱水萃取物之還原力。……104

附圖目錄
附圖一 酚硫酸法之葡萄糖標準曲線。……123
附圖二 葡萄糖之HPLC殘糖檢量線。……124
附圖三 測定β-(1→3)-D-glucan相對含量之laminarin標準曲線。……125
附圖四 多醣分子量之標準曲線。……126
附圖五 搖瓶培養發酵液乙醇萃取物之DPPH自由基清除力標準曲……127
附圖六 氣泡式發酵槽發酵液乙醇萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……128
附圖七 攪拌式發酵槽發酵液乙醇萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……129
附圖八 氣舉式發酵槽發酵液乙醇萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……130
附圖九 搖瓶培養發酵液熱水萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……131
附圖十 氣泡式發酵槽發酵液熱水萃取物之DPPH自由基清除力標準線。……132
附圖十一 攪拌式發酵槽發酵液熱水萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……133
附圖十二 氣舉式發酵槽發酵液熱水萃取物之DPPH自由基清除力標準曲線。……134
附圖十三 BHA之DPPH自由基清除力標準曲線。……135
附圖十四 Ascorbic acid 之DPPH自由基清除力標準曲線。……136
附圖十五 α-tocopherol之DPPH自由基清除力標準曲線。……137
附圖十六 搖瓶培養發酵液乙醇萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……138
附圖十七 氣泡式發酵槽發酵液乙醇萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……139
附圖十八 攪拌式發酵槽發酵液乙醇萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……140
附圖十九 氣舉式發酵槽發酵液乙醇萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……141
附圖二十 搖瓶培養發酵液熱水萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……142
附圖二十一 氣泡式發酵槽發酵液熱水萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……143
附圖二十二 攪拌式發酵槽發酵液熱水萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……144
附圖二十三 氣舉式發酵槽發酵液熱水萃取物之總抗氧化能力標準曲線。……145
附圖二十四 Trolox之總抗氧化力標準曲線。……146
附圖二十五 搖瓶培養發酵液乙醇萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……147
附圖二十六 氣泡式發酵液乙醇萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……148
附圖二十七 攪拌式發酵液乙醇萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……149
附圖二十八 氣舉式發酵液乙醇萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……150
附圖二十九 搖瓶培養發酵液熱水萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……151
附圖三十 氣泡式發酵液熱水萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……152
附圖三十一 攪拌式發酵液熱水萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……153
附圖三十二 氣舉式發酵液熱水萃取物之螯合亞鐵離子能力標準曲線。……154
附圖三十三 EDTA之螯合亞鐵離子標準曲線。……155
附圖三十四 搖瓶培養發酵液乙醇萃取物之還原力標準曲線。……156
附圖三十五 氣泡式發酵槽發酵液乙醇萃取物之還原力標準曲線。……157
附圖三十六 攪拌式發酵槽發酵液乙醇萃取物之還原力標準曲線。……158
附圖三十七 氣舉式發酵槽發酵液乙醇萃取物之還原力標準曲線。……159
附圖三十八 搖瓶培養發酵液熱水萃取物之還原力標準曲線。……160
附圖三十九 氣泡式發酵槽發酵液熱水萃取物之還原力標準曲線。……161
附圖四十 攪拌式發酵槽發酵液熱水萃取物之還原力標準曲線。……162
附圖四十一 氣舉式發酵槽發酵液熱水萃取物之還原力標準曲線。……163
附圖四十二 BHA之還原力標準曲線。……164
附圖四十三 Ascorbic acid之還原力標準曲線。……165
附圖四十四 α-tocopherol之還原力標準曲線。……166
附圖四十五 以搖瓶培養對數生長期之曲線測定白樺茸菌比生長速率(μ)。……167
附圖四十六 以氣泡式發酵槽對數生長期之生長曲線測定白樺茸菌比生長速率(μ)。……168
附圖四十七 以攪拌式發酵槽對數生長期之生長曲線測定白樺茸菌比生長速率(μ)。……169
附圖四十八 以氣舉式發酵槽對數生長期之生長曲線測定白樺茸菌比生長速率(μ)。……170
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