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研究生:陳俊杰
研究生(外文):Chun Chieh Chen
論文名稱:雙頻率雷射掃描共焦螢光顯微鏡縱向解析度改善之研究
論文名稱(外文):Improvement of fluorescence axial resolution in Two-Frequency Laser Scanning Confocal Microscope
指導教授:邱顯欽周晟周晟引用關係
指導教授(外文):H. C. ChiuC. Chou
學位類別:碩士
校院名稱:長庚大學
系所名稱:光電工程研究所
學門:工程學門
學類:電資工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2015
畢業學年度:103
論文頁數:97
中文關鍵詞:雷射掃描共焦顯微鏡雙頻率雷射低同調度雙頻率雷射掃描共焦顯微鏡 
外文關鍵詞:Laser Scanning Confocal MicroscopyTwo-Frequency LaserLow Coherence Two-Frequency Laser Scanning Confocal Microscopy
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目錄
指導教授推薦書
口試委員會審定書
誌謝 iii
中文摘要 iv
Abstract v
目錄 vi
圖目錄 ix
第一章 緒論 - 1 -
1.1 雷射掃描共焦顯微鏡的背景介紹 - 1 -
1.2螢光顯微術的應用 - 9 -
1.3 雷射掃描共焦顯微鏡的掃描影像的極限 - 10 -
1.3.1 繞射極限 - 11 -
1.3.2 像差 - 13 -
1.3.3 散射 - 16 -
1.4 雙頻率雷射掃描共焦顯微鏡 - 18 -
第二章 影像成像原理 - 21 -
2.1 雷射掃描共焦顯微鏡 (Laser Scanning Confocal Microscope, LSCM)成像理論 - 21 -
2.2 雙頻率雷射掃描共焦顯微鏡 (Two-Frequency Laser Scanning Confocal Microscope, TFLSCM)非螢光樣本成像理論 - 24 -
2.3 雙頻率雷射掃描共焦顯微鏡 (Two-Frequency Laser Scanning Confocal Microscope, TFLSCM)螢光樣本成像理論 - 27 -
第三章 實驗研究設置 - 29 -
3.1 TFLSCM非螢光樣本實驗設置 - 29 -
3.2 LSCM非螢光樣本實驗設置(與TFLSCM共光路) - 32 -
3.3 TFLSCM螢光樣本實驗設置 - 34 -
3.4 LSCM螢光樣本實驗設置(與TFLSCM共光路) - 36 -
3.5 比較TFLSCM及LSCM(與TFLSCM共光路)於螢光樣本中引入球面像差和散射粒子後系統橫向解析度實驗設置 - 37 -
第四章 實驗結果與討論 - 39 -
4.1 比較非螢光樣本中TFLSCM與LSCM的縱向解析能力 - 39 -
4.2 比較於非螢光樣本中引入球面像差後TFLSCM與LSCM的縱向解析能力 - 41 -
4.3 比較螢光樣本中TFLSCM與LSCM的縱向解析能力 - 43 -
4.3.1 於TFLSCM與LSCM系統中使用直徑大小為0.2μm之螢光小球製作不同濃度螢光樣本並比較兩系統的縱向解析能力 - 43 -
4.3.2 於TFLSCM與LSCM系統中使用直徑大小為1μm之螢光小球製作不同濃度螢光樣本並比較兩系統的縱向解析能力 - 48 -
4.4 於螢光樣本中引入球面像差後比較TFLSCM與LSCM的縱向解析能力 - 53 -
4.5 比較LCTFLSCM干涉效率70%(MI, Modulation Index)與LSCM的縱向解析能力 - 55 -
4.5.1 比較使用直徑大小為0.2μm之螢光小球製作不同濃度螢光樣本在LCTFLSCM(MI70%)與LSCM的縱向解析能力 - 55 -
4.5.2 比較使用直徑大小為1μm之螢光小球製作不同濃度螢光樣本在LCTFLSCM (MI70%)與LSCM的縱向解析能力 - 59 -
4.6 比較於螢光樣本中TFLSCM與LSCM的橫向解析能力 - 64 -
4.7 結論與未來展望 - 66 -
第五章 參考文獻 - 68 -


圖目錄

圖1.1 生物體的尺度圖及一般儀器能看到的物體大小 - 12 -
圖1.2 雷射共焦顯微鏡基本架構示意圖 - 14 -
圖1.3 半高寬u1/2(正比於實際縱向解析半高寬值Z1/2)對應之針孔大小vp(正比於真實的針孔半徑rp)關係曲線圖。根據此圖計算出針孔大小在vp≈ 2.5時,系統具有最好的斷層解析能力。 - 15 -
圖1.4 單狹縫(或點光源)的光場強度分佈在遠場形成的繞射光場分佈 - 16 -
圖1.5 光學系統的數值孔徑(Numerical Aperture, N.A.)示意圖 - 17 -
圖1.6傳統雷射掃描共焦顯微鏡在無球面像差狀態下掃描之縱向解析曲線圖 - 18 -
圖1.7 (A) 雷射掃描式共焦顯微鏡細胞掃描影像圖 (B) 傳統光學顯微鏡細胞掃描影像圖 - 19 -
圖1.11 (A)光波通過大孔徑狹縫示意圖(B)光波通過小孔徑狹縫示意圖 - 21 -
圖1.12 單狹縫繞射圖形 - 21 -
圖1.13 艾瑞盤Airy disk - 22 -
圖1.14 (a)無球面像差示意圖 (b)球面像差示意圖 - 23 -
圖1.15 縱向與橫向球面像差示意圖 - 24 -
圖1.16 使用非球面透鏡降低球面像差示意圖 - 25 -
圖1.17 使用油鏡掃描影像示意圖。由圖1.17(a)可以得知當掃描影像在蓋玻片上時,油鏡消除球面像差的能力非常明顯,而圖1.17(b)表示當掃描影像穿越蓋玻片到了樣品內部時,油鏡消除球面像差的能力就沒有那麼優秀,水鏡同樣只有在樣品表層能有效消除球面像差,掃描至樣品深處時就無法將之消除。 - 25 -
圖1.8 光散射示意圖 - 26 -
圖1.9 Rayleigh散射角度示意圖 - 27 -
圖1.10 顯微成像光散射示意圖 - 27 -
圖1.18 TFLSCM和LCTFLSCM空間解析度示意圖 - 29 -
圖1.19 LCTFLSCM實驗架構 - 30 -
圖1.20 LCTFLSCM在鏡子上之空間解析度 - 30 -
圖2.1 反射式共焦顯微鏡架構示意圖 - 31 -
圖3.1 TFLSCM架構示意圖 - 39 -
圖3.2 TFLSCM掃描反射面鏡之縱向解析度 - 41 -
圖3.3 LCTFLSCM非螢光樣本實驗設置 - 41 -
圖3.4 與TFLSCM共光路之LSCM架構示意圖 - 42 -
圖3.5 雷射共焦顯微鏡LSCM掃描鏡子之縱向解析度 - 43 -
圖3.6 TFLSCM螢光樣本實驗設置 - 44 -
圖3.7 LCTFLSCM螢光樣本實驗設置 - 45 -
圖3.8 LSCM螢光樣本實驗設置 - 46 -
圖3.9 TFLSCM實驗設置 - 47 -
圖3.10 LSCM實驗設置(與TFLSCM共光路) - 47 -
圖3.11 以洋菜凍(Gel)將散射粒子(Polystyrene beads, 347nm)與螢光小球(Fluorescence beads, 200nm)包覆借而導入球面像差和散射等影響因素的樣本製備 - 48 -
圖4.1 非螢光樣本中TFLSCM與LSCM縱向解析能力之比較 - 49 -
圖4.2 非螢光樣本中TFLSCM與LSCM縱向解析能力(主峰半高寬FWHM, Full width at half maximum)做圖,副座標軸是以Nomod取得之縱向解析度為標準,不同同調度的雙頻率雷射光源系統取得之縱向解析度改善效率值 - 50 -
圖4.3 於非螢光樣本中引入球面像差實驗架設圖 - 51 -
圖4.4 於非螢光樣本中引入球面像差並比較TFLSCM與LSCM的縱向解析能力 - 51 -
圖4.5 於非螢光樣本中引入球面像差TFLSCM與LSCM縱向解析能力(主峰半高寬FWHM, Full width at half maximum)做圖,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 52 -
圖4.6 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.028mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 53 -
圖4.7 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.028mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 53 -
圖4.8 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.031mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 54 -
圖4.9 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.031mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 54 -
圖4.10 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.032mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 55 -
圖4.11 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.032mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而本次實驗無法分析出LSCM系統縱向解析度故無法做增進效率的分析 - 55 -
圖4.12 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.044mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 56 -
圖4.13 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.044mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 56 -
圖4.14 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.016mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 58 -
圖4.15 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.016mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 58 -
圖4.16 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.024mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 59 -
圖4.17 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.024mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 59 -
圖4.18 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.057mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 60 -
圖4.19 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.057mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 60 -
圖4.20 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.105mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 61 -
圖4.21 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.105mVDC之螢光樣本並比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力主峰半高寬(FWHM, Full width at half maximum)比較作圖,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較,然而其副座標軸為以Nomod為標準雙頻率雷射光源各干涉效率的改善效率值 - 61 -
圖4.22 於螢光樣本中引入球面像差實驗架設圖 - 63 -
圖4.23 以直徑1μm螢光小球製備之螢光樣本加上一片蓋玻片(Coverglass, 0.17mm)產生球面像差並選取螢光濃度(螢光強度)0.012mVDC比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 63 -
圖4.24 以直徑1μm螢光小球製備之螢光樣本加上一片蓋玻片(Coverglass, 0.17mm)產生球面像差並選取螢光濃度(螢光強度)0.022mVDC比較TFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,實驗中我們不斷降低TFLSCM雷射光源同調度掃描樣本取得縱向解析度後比較 - 64 -
圖4.25 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.017mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 65 -
圖4.26 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.017mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 65 -
圖4.27 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.037mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 66 -
圖4.28 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.037mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 66 -
圖4.30 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.065mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 67 -
圖4.31 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.069mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 67 -
圖4.32 以直徑0.2μm螢光小球製備螢光強度為0.069mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 68 -
圖4.33 以直徑0.2μm螢光小球製備不同螢光強度之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 68 -
圖4.34 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.025mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 69 -
圖4.35 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.025mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 70 -
圖4.36 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.057mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 70 -
圖4.37 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.057mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 71 -
圖4.38 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.058mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 71 -
圖4.39 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.058mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 72 -
圖4.40 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.061mVDC之螢光樣本並比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析能力,根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 72 -
圖4.41 以直徑1μm螢光小球製備螢光強度為0.061mVDC之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 73 -
圖4.42 以直徑1μm螢光小球製備不同螢光強度之螢光樣本並作圖比較LCTFLSCM與LSCM系統的縱向解析度半高寬(FWHM, Full width at half maximum),根據經驗我們將LCTFLSCM光源系統同調度固定於70%時擁有較優秀的SNR且有效地提升縱向解析度 - 73 -
圖4.43 將螢光小球(Fluorescence beads, 200nm)以洋菜凍(Gel)包覆並撒入白膠粒子(Polystyrene beads, 347nm)借而導入球面像差和散射等影響因素。圖4.41(A)為TFLSCM掃描取得之影像,樣本深度為125μm。圖4.41(B)為LSCM掃描取得之影像,樣本深度同為125μm。 - 74 -
圖4.44 螢光樣本掃描深度為125μm 時,TFLSCM與LSCM掃描取得之特定部分影像而圖4.42(B) Mod(Modulation)為TFLSCM掃描之影像、圖4.42(C) Nomod(No modulation)則是LSCM掃描之影像。圖4.42(A) 為Mod、Nomod兩系統橫向解析度之比較 - 75 -

參考文獻
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(Interface Focus, DOI: 10.1098 / rsfs.2013.0007)

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