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研究生:張天耀
研究生(外文):Tian Yao Jhang
論文名稱:培養條件與逆境生長環境因素對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份之影響
論文名稱(外文):Effects of Culture Condition and Adverse Environmental Factors on Mycelial Biomass and Bioactive Ingredients Production in the Submerged Culture of Xylaria nigripes
指導教授:徐泰浩徐泰浩引用關係林芳儀林芳儀引用關係
指導教授(外文):Tai Hao HsuFang Yi Lin
口試委員:梁志欽許文光
口試委員(外文):Zeng Chin LiangWen Kuang Hsu
口試日期:2015-05-29
學位類別:碩士
校院名稱:大葉大學
系所名稱:生物產業科技學系
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2015
畢業學年度:103
語文別:中文
論文頁數:73
中文關鍵詞:烏靈參液態發酵逆境二階段培養生物活性成份
外文關鍵詞:Xylaria nigripessubmerged culturesenvironmental stresstwo stage culturebioactive ingredient
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烏靈參(Xylaria nigripes)為一種珍貴藥用真菌,其生長過程中會代謝出許多產物,如三萜類、多醣體、腺苷及總多酚等,這些產物具有抗癌、抗發炎、抗血栓及抗氧化等功效。以液態發酵培養真菌具有培養時間短、品質穩定及容易控制培養環境等優點,液態培養過程中環境因子對於菌絲體生長與代謝產物生成有著密切關係,然而代謝產物通常在真菌於生長過程中受到培養環境壓力之刺激才會大量生成。由於目前國際上關於烏靈參液態發酵之文獻極少,因此本研究主要探討基礎培養條件不同接菌量、轉速、初始pH、固定化結合二階培養及以逆境生長調控pH、逆境生長控制溫度、飢餓培養及添加不同濃度之雙氧水等培養條件對烏靈參液態發酵菌絲體、胞外多醣、胞內多醣、腺苷、粗三萜及總多酚產量之影響。基礎培養條件為2.5 %接菌量、攪拌速率150 rpm、初始pH 4.0、固定化結合二階其菌絲體、胞外多醣、胞內多醣、腺苷、粗三萜及總多酚產量分別為2.15 g/L、0.66 g/L、7.52 mg/g、1.13 mg/g、9.63 mg/g及6.98 mg/g。逆境生長條件培養第0~4天時恆溫25℃、初始pH 5.0最適菌絲體生長環境,當培養至第4天菌絲體產率達最高時,將溫度改變為20℃、初始pH 改為4.0及添加4 mmol / L雙氧水其菌絲體、胞外多醣、胞內多醣、腺苷、粗三萜及總多酚產量分別為3.40 g/L、1.26 g/L、15.52 mg/g、2.50 mg/g、4.84 mg/g及6 mg/g。實驗結果顯示以逆境生長環境培養烏靈參可達到提高菌絲體及大量合成代謝物產量之效果。

Xylaria nigripes is a precious medicinal fungus. It produces several kinds of bioactive ingredients during its growing period, such as crude triterpenoid, polysaccharide, adenosine and total polyphenol. These by-products contain the therapeutic effects of anti-cancer, anti-inflammation, anti-thrombosis and anti-oxidation.Submerged cultures is thought to be efficient and stable. It is also easy to control the cultivation environment. Under submerged cultures, environmental factors play important role in the growth and bioactive ingredients production of mycelium that a great amount of bioactive ingredients can only be produced with environmental stress. There is currently little research about submerged cultures of Xylaria nigripes. Accordingly, we investigate the yield of extracellular polysaccharide, intracellular polysaccharide, adenosine, crude triterpenoid and total polyphenol from Xylaria nigripes mycelium under submerged cultures with standardized cultivation procedure and variable cultivation conditions. The cultivation variables include inoculation, agitation rate, initial pH, two-stage culture with immobilization and environmental stress with control pH, temperature, nutrient starvation and hydrogen peroxide with different concentration.Under the standardized cultivation procedure of 2.5% of inoculation, 150rpm, initial pH 4.0 and two-stage culture with immobilization, the yield of mycelium, extracellular polysaccharide, intracellular polysaccharide, adenosine, crude triterpenoid and total polyphenol is 2.15 g/L, 0.66 g/L, 7.52 mg/g, 1.13 mg/g, 9.63 mg/g and 6.98 mg/g, respectively.The procedure of environmental stress starts with constant temperature of 25℃and pH 5.0, which is the optimal environment for mycelium to grow, from day 0 to day 3. When the yield of mycelium reaches the maximum at day 4, the temperature switches to 20℃and pH 4.0 with additional 4 mmol/ L hydrogen peroxide. Under this procedure, the yield of mycelium, extracellular polysaccharide, intracellular polysaccharide, adenosine, crude triterpenoid and total polyphenol is 3.40 g/L, 1.26 g/L, 15.52 mg/g, 2.50 mg/g, 4.84 mg/g and 6.00 mg/g, respectively.The results show that the cultivation procedure with environmental stress can increase the mycelium growth and the yield of bioactive ingredients.

封面內頁
簽名頁
中文摘要iii
英文摘要v
誌謝vii
目錄viii
圖目錄xiii
表目錄xv

1.前言1
2.文獻回顧3
2.1 烏靈參簡介3
2.1.1 烏靈參分類3
2.1.2 烏靈參分佈與生長環境 3
2.2 菇類液態發酵之優勢5
2.3 液態發酵環境因子6
2.3.1 攪拌速率6
2.3.2 溫度6
2.3.3 接菌量7
2.3.4 pH7
2.3.5 二次代謝產物、逆境效應及兩階段控制培養環境8
2.4 飢餓壓力9
2.5 發酵工程9
3.材料與方法11
3.1 實驗架構11
3.2 實驗材料12
3.2.1 實驗菌株12
3.2.2 實驗藥品12
3.2.3 實驗儀器14
3.3 烏靈參菌株培養16
3.3.1 菌種培養16
3.3.2 液態搖瓶菌種培養16
3.3.3 菌種保存17
3.3.4 五公升發酵槽液態培養條件17
3.4 五公升發酵槽液態基礎培養試驗18
3.4.1 不同初始pH對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響18
3.4.2 不同接菌量對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響18
3.4.3 不同攪拌速率對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響18
3.4.4 二階培養對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響19
3.4.5二階培養結合細胞固定化對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響20
3.5 五公升發酵槽逆境生長之液態培養試驗20
3.5.1 逆境生長因素對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響20
3.5.2 逆境生長溫差之環境因素對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響21
3.5.3 兩階段添加不同濃度雙氧水對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響21
3.5.4 兩階段控制不同pH對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響22
3.6 分析方法23
3.6.1 pH值測定23
3.6.2 菌絲體生物質量之測定23
3.6.3 多醣含量之測定23
3.6.3.1 發酵液胞外多醣(Entracellular polysaccharides)製備23
3.6.3.2 菌絲體萃取胞內多醣(Intracellular polysaccharides)之製備24
3.6.3.3 多醣檢量線之測定24
3.6.3.4 苯酚 - 硫酸呈色法測定多醣含量25
3.6.4 DNS法測定果糖(Residual sugar)含量25
3.6.5 粗三萜(Triterpenoids)含量測定26
3.6.5.1 菌絲體萃取粗三萜之製備26
3.6.5.2 粗三萜檢量線之測定 26
3.6.5.3 香草醛-冰醋酸比色法測定粗三萜含量27
3.6.6.1 菌絲體萃取總多酚之製備27
3.6.6.2 總多酚檢量線之測定 27
3.6.6.3 Folin-Ciocalteu 比色法測定總多酚含量28
3.6.7 腺苷(Adenosine)含量測定28
3.6.7.1 Adenosine檢量線之測定29
4.結果與討論30
4.1 五公升發酵槽液態基礎培養烏靈參30
4.1.1 不同初始pH對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響30
4.1.2 不同接菌量對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響34
4.1.3 不同攪拌速率對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響37
4.1.4 二階培養與二階結合細胞固定化培養烏靈參對其液態發酵菌絲體與生物活性產量之影響40
4.2 五公升發酵槽逆境生長之液態培養試驗44
4.2.1逆境生長因素對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響44
4.2.2逆境生長溫差之環境因素對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響48
4.2.3兩階段添加不同濃度雙氧水對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響52
4.2.4兩階段控制不同pH對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響57
4.2.5初始培養、最適基礎培養及逆境生長環境三種培養條件對烏靈參液態發酵菌絲體與生物活性成份產量之影響61
5.結論66
參考文獻67

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