臺灣博碩士論文加值系統

血管新生 (angiogenesis) 是癌細胞在生長成相當體積的腫瘤時，在養分缺乏及缺氧 (hypoxia) 所發展出來的一種機制。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor; VEGF) 被視為血管新生中最重要的因子。VEGF具有調控細胞生長、遷移 (migration) 及血管形成 (tube formation) 等功能，因此經常被作為腫瘤診斷與治療的重要生物指標。本研究以人類臍靜脈細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cell; HUVEC) 為模式，在有VEGF (0.5 nM)存在下，HUVEC增生增加5倍。以兩種具 anti-VEGF 專一性適體(Aptamer; Apt)分別是Del5-1和Vt71修飾於金奈米粒子 (gold nanoparticles; Au NPs)，具備抑制 VEGF 活性，並抑制HUVEC細胞生長。我們製備Apt−Au NPs是利用polyAn(n=21)的方式以adenine上imidazole與金結合，結合作用力為120 kJ/mole。此方法具備成本低、結合力強、製備簡單、可調整密度等優點。初步結果顯示核酸適體Del5-1 和 V7t1修飾之Au NPs (AptDel5-1/V7t1−Au NPs)可抑制3成的細胞存活 (cell viability)。細胞增生 (cell proliferation)實驗結果顯示核酸適體修飾之Au NPs可以抑制3成由VEGF所誘導的細胞增生，細胞遷徏 (cell migration)實驗進一步證實核酸適體修飾之Au NPs對於細胞的移動也具備抑制的能力從100%到50%。我們的結果顯示AptDel5-1/V7t1−Au NPs有潛力作為抗血管新生治療藥物。

Angiogenesis was an essentially physiological process when cancer cells grew to 1 mm which suffered low nutrient and hypoxia. Vascular endothelial growth factor (VEGF) was a key protein in stimulating angiogenesis and regulating endothelial cells proliferation, migration and tube formation. VEGF was also an important target for cancer detection and therapy. In our study, we used human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) as model to investigate the inhibition capacity of VEGF by non-covalent aptamer-modified gold nanoparticles (Apt−Au NPs). Two kinds of specific anti-VEGF aptamer (Del5-1, V7t1) conjugated with Au NPs could inhibit VEGF activity efficiently and suppress HUVECs growth. We prepared Apt−Au NPs through the terminal polyA of aptamer capped on the Au NPs. The non-covalent Apt−Au NPs bioconjugates possess advantages such as low cost, high binding affinity, simple preparation and easy control of aptamer density on Au NPs. In our results, we demonstrated aptamer Del5-1 and aptamer V7t1 conjugated with Au NPs could inhibit 30% cell survival by cell viability assay. In cell proliferation assay, we found that Apt−Au NPs could suppress 30% cell growth. In wound healing assay, Apt−Au NPs induced the decrease in 50% of cell migration. Therefore, AptDel5-1/V7t1−Au NPs have a great potential as a drug for anti-angiogenesis.

中文摘要 i
Abstract ii
第一章 緒論 1
1. 血管新生(angiogenesis) 1
1.1 血管新生因子 1
1.2 內皮細胞的血管新生 1
1.3癌症的血管型態 1
2. 血管內皮生長因子(VEGF) 2
2.1 VEGF-A 2
2.2 VEGF receptor (VEGFR) 2
3. 抗血管新生治療 3
3.1 抗血管新生治療與化學治療 3
3.2 血管新生藥物效率 3
3.3 現行抗血管新生藥物 4
3.3.1 抑制VEGF藥物 4
3.3.2 抑制VEGF-R藥物 4
3.3.3 小分子藥物 (small molecular weight drug) 4
3.3.4 其他藥物 5
3.4血管新生治療的挑戰 5
3.5 奈米材料應用在抗血管新生 5
3.5.1金奈米粒子抑制血管新生 5
3.5.2 氧化亞銅奈米粒子抑制血管新生 6
3.5.3 二氧化鈦抑制血管新生 6
3.5.4 銀奈米粒子抑制血管新生 6
4.適體於抗血管新生應用 6
4.1 Del5-1 aptamer 6
4.2 V7t1 aptamer 7
4.3 現行適體藥物 7
4.4 適體修飾之氧化鐵奈米粒子 7
5. 研究動機 8
第二章 核酸適體修飾之金奈米粒子於抑制血管內皮生長因子應用 9
1. 前言 9
2. 實驗材料與方法 10
2.1 實驗材料 10
2.2 儀器設備 10
2.3 溶液配置 10
2.4實驗方法 11
3. 結果與討論 14
3.1 核酸適體Del5-1和V7t1之金奈米粒子定量 14
3.2 核酸適體Del5-1/V7t1之金奈米粒子穩定度測試 14
3.3 核酸適體Del5-1和V7t1之金奈米粒子與VEGF結合能力測試 14
3.4 核酸適體Del5-1和V7t1之金奈米粒子抑制HUVECs細胞株之增生和存活 15
3.5 核酸適體Del5-1和V7t1之金奈米粒子抑制HUVECs細胞株之細胞遷徏 15
4. 結論 16
參考文獻 17
本文圖表 22

1. Timar, J.; Dome, B.; Fazekas, K.; Janovics, A.; Paku, S. Pathol. Oncol. Res. 2001, 7, 85
2. Pober, J. S.; Sessa, W. C. Nat. Rev. Immunol. 2007, 7, 803.
3. Folkman, J.; Long, D. M., Jr.; Becker, F. F. Cancer 1963, 16, 453.
4. Folkman, J. N. Engl. J. Med. 1971, 285, 1182.
5. Shing, Y.; Folkman, J.; Sullivan, R.; Butterfield, C.; Murray, J.; Klagsbrun, M. Science 1984, 223, 1296.
6. Cross, M. J.; Claesson–Welsh, L. Pathol. Oncol. Res.Trends Pharmacol. Sci. 2001, 22, 201.
7. Salven, P.; Hattori, K.; Heissig, B.; Rafii, S. FASEB J. 2002, 16, 1471.
8. Gillis, P.; Savla, U.; Volpert, O. V.; Jimenez, B.; Waters, C. M.; Panos, R. J.; Bouck, N. P. J. Cell Sci. 1999, 112, 2049.
9. Sato, N.; Beitz, J. G.; Kato, J.; Yamamoto, M.; Clark, J. W.; Calabresi, P.; Raymond, A.; Frackelton, A. R., Jr. Am. J. Pathol. 1993, 142, 1119.
10. Herbert, S. P.; Stainier, D. Y. R. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2011, 12, 551.
11. Fukumura, D.; Jain, R. K. J. Cell Biochem. 2007, 101, 937.
12. Jain, R. K. Science 2005, 307, 58.
13. Jain, R. K. Clin. Cancer Res. 1999, 5, 1605.
14. Senger, D. R.; Galli, S. J.; Dvorak, A. M.; Perruzzi, C. A.; Harvey, V. S.; Dvorak, H. F. Science 1983, 219, 983.
15. Neufeld, G.; Cohen, T.; Gengrinovitch, S.; Poltorak, Z. FASEB J. 1999, 13, 9.
16. Muller, Y. A.; Heiring, C.; Misselwitz, R.; Welfle, K.; Welfle, H. J. Biol. Chem. 2002, 277, 43410.
17. Harper, S. J.; Bates, D. O. Nat. Rev. Cancer 2008, 8, 880.
18. Suto, K.; Yamazaki, Y.; Morita, T.; Mizuno, H. J. Biol. Chem. 2005, 280, 2126.
19. Kasap, M.; Sazci, A. J. Theor. Biol. 2008, 253, 446.
20. Fairbrother, W. J.; Champe, M. A.; Christinger, H. W.; Keyt, B. A.; Starovasnik, M. A. Structure 1998, 6, 637.
21. Schlessinger, J.; Lax, I.; Lemmon, M. Cell 1995, 83, 357.
22. Gitay-Goren, H.; Soker, S.; Vlodavsky, I.; Neufeld, G. J. Biol. Chem. 1992, 267, 6093.
23. Poltorak, Z.; Cohen, T.; Sivan, R.; Kandelis, Y.; Spira, G.; Vlodavsky, I.; Keshet, E.; Neufeld, G. J. Biol. Chem. 1997, 272, 7151.
24. Yue, X.; Tomanek, R. J. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2001, 280, H2240.
25. Shibuya, M.; Yamaguchi, S.; Yamane, A.; Ikeda, T.; Tojo, A.; Matsushime, H.; Sato, M. Oncogene 1990, 5, 519.
26. Tremmel, M.; Matzke, A.; Albrecht, I.; Laib, A. M.; Olaku, V.; Ballmer-Hofer, K.; Christofori, G.; Heroult, M.; Augustin, H. G.; Ponta, H.; Orian-Rousseau, V. Blood 2009, 114, 5236.
27. Pajusola, K.; Aprelikova, O.; Korhonen, J.; Kaipainen, A.; Pertovaara, L.; Alitalo, R.; Alitalo, K. Cancer Res. 1992, 52, 5738.
28. Neufeld, G.; Kessler, O.; Herzog, Y. Adv. Exp. Med. Biol. 2002, 515, 81.
29. Tessler, S.; Rockwell, P.; Hicklin, D.; Cohen, T.; Levi, B. Z.; Witte, L.; Lemischka, I. R.; Neufeld, G. J. Biol. Chem. 1994, 269, 12456.
30. Cebe-Suarez, S.; Grunewald, F. S.; Jaussi, R.; Li, X.; Claesson-Welsh, L.; Spillmann, D.; Mercer, A. A.; Prota, A. E.; Ballmer-Hofer, K. FASEB J. 2008, 22, 3078.
31. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, M. S.; Wildiers, H.; Van Oosterom, A. T.; De Bruijn, E. A. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549.
32. Ruch, C.; Skiniotis, G.; Steinmetz, M. O.; Walz, T.; Ballmer-Hofer, K. Nat. Struct. Mol. Biol. 2007, 14, 249.
33. Kisko, K.; Brozzo, M. S.; Missimer, J.; Schleier, T.; Menzel, A.; Leppanen, V. M.; Alitalo, K.; Walzthoeni, T.; Aebersold, R.; Ballmer-Hofer, K. FASEB J. 2011, 25, 2980.
34. Brozzo, M. S.; Bjelic, S.; Kisko, K.; Schleier, T.; Leppanen, V. M.; Alitalo, K.; Winkler, F. K.; Ballmer-Hofer, K. Blood 2012, 119, 1781.
35. Leppanen, V. M.; Prota, A. E.; Jeltsch, M.; Anisimov, A.; Kalkkinen, N.; Strandin, T.; Lankinen, H.; Goldman, A.; Ballmer-Hofer, K.; Alitalo, K. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 2425.
36. Hyde, C. A.; Giese, A.; Stuttfeld, E.; Abram Saliba, J.; Villemagne, D.; Schleier, T.; Binz, H. K.; Ballmer-Hofer, K. Mol. Cell Biol. 2012, 32, 3802.
37. Dosch, D. D.; Ballmer-Hofer, K. FASEB J. 2010, 24, 32.
38. Folkman, J. Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6, 273.
39. Kerbel, R. S. Bioessays 1991, 13, 31.
40. Rak, J.; Kerbel, R. S. Cancer Metastasis Rev. 1996, 15, 231.
41. Ebos, J. M.; Lee, C. R.; Cruz-Munoz, W.; Bjarnason, G. A.; Christensen, J. G.; Kerbel, R. S. Cancer cell 2009, 15, 232.
42. Jain, R. K. Nat. Med. 2001, 7, 987.
43. Jain, R. K. Oncology 2005, 19, 7.
44. Kisker, O.; Becker, C. M.; Prox, D.; Fannon, M.; D'Amato, R.; Flynn, E.; Fogler, W. E.; Sim, B. K.; Allred, E. N.; Pirie-Shepherd, S. R.; Folkman, J. Cancer Res. 2001, 61, 7669.
45. Boehm, T.; Folkman, J.; Browder, T.; O'Reilly, M. S. Nature 1997, 390, 404.
46. Slaton, J. W.; Perrotte, P.; Inoue, K.; Dinney, C. P.; Fidler, I. J. Clin. Cancer Res. 1999, 5, 2726.
47. Panigrahy, D.; Singer, S.; Shen, L. Q.; Butterfield, C. E.; Freedman, D. A.; Chen, E. J.; Moses, M. A.; Kilroy, S.; Duensing, S.; Fletcher, C.; Fletcher, J. A.; Hlatky, L.; Hahnfeldt, P.; Folkman, J.; Kaipainen, A. J. Clin. Invest. 2002, 110, 923.
48. Ferrara, N.; Kerbel, R. S. Nature 2005, 438, 967.
49. Hurwitz, H.; Fehrenbacher, L.; Novotny, W.; Cartwright, T.; Hainsworth, J.; Heim, W.; Berlin, J.; Baron, A.; Griffing, S.; Holmgren, E.; Ferrara, N.; Fyfe, G.; Rogers, B.; Ross, R.; Kabbinavar, F. N. Engl. J. Med. 2004, 350, 2335.
50. Escudier, B.; Pluzanska, A.; Koralewski, P.; Ravaud, A.; Bracarda, S.; Szczylik, C.; Chevreau, C.; Filipek, M.; Melichar, B.; Bajetta, E.; Gorbunova, V.; Bay, J. O.; Bodrogi, I.; Jagiello-Gruszfeld, A.; Moore, N.; investigators, A. T. Lancet 2007, 370, 2103.
51. Friedman, H. S.; Prados, M. D.; Wen, P. Y.; Mikkelsen, T.; Schiff, D.; Abrey, L. E.; Yung, W. K.; Paleologos, N.; Nicholas, M. K.; Jensen, R.; Vredenburgh, J.; Huang, J.; Zheng, M.; Cloughesy, T. J. Clin. Oncol. 2009, 27, 4733.
52. Sandler, A.; Gray, R.; Perry, M. C.; Brahmer, J.; Schiller, J. H.; Dowlati, A.; Lilenbaum, R.; Johnson, D. H. New Engl. J. Med. 2006, 355, 2542.
53. Teng, L. S.; Jin, K. T.; He, K. F.; Zhang, J.; Wang, H. H.; Cao, J. J. Chin. Med. Assoc. 2010, 73, 449.
54. Spratlin, J. Curr. Oncol. Rep. 2011, 13, 97.
55. Zhu, Z.; Witte, L. Invest. New Drugs 1999, 17, 195.
56. Gotink, K. J.; Verheul, H. M. Angiogenesis 2010, 13, 1.
57. Verweij, J.; de Jonge, M. J. Clin. Oncol. 2007, 25, 2340.
58. Brave, S. R.; Odedra, R.; James, N. H.; Smith, N. R.; Marshall, G. B.; Acheson, K. L.; Baker, D.; Howard, Z.; Jackson, L.; Ratcliffe, K.; Wainwright, A.; Lovick, S. C.; Hickinson, D. M.; Wilkinson, R. W.; Barry, S. T.; Speak, G.; Ryan, A. J. Int. J. Oncol. 2011, 39, 271.
59. Demetri, G. D.; van Oosterom, A. T.; Garrett, C. R.; Blackstein, M. E.; Shah, M. H.; Verweij, J.; McArthur, G.; Judson, I. R.; Heinrich, M. C.; Morgan, J. A.; Desai, J.; D Fletcher, C.; George, S.; Bello, C. L.; Huang, X.; Baum, C. M.; Casali, P. G. Lancet 2006, 368, 1329.
60. Motzer, R. J.; Michaelson, M. D.; Rosenberg, J.; Bukowski, R. M.; Curti, B. D.; George, D. J.; Hudes, G. R.; Redman, B. G.; Margolin, K. A.; Wilding, G. J. Urology 2007, 178, 1883.
61. Himmelsbach, K.; Sauter, D.; Baumert, T. F.; Ludwig, L.; Blum, H. E.; Hildt, E. Gut 2009, 58, 1644.
62. Ruegg, C.; Mutter, N. B. Cancer 2007, 94, 753.
63. Lu, C.; Lee, J. J.; Komaki, R.; Herbst, R. S.; Feng, L.; Evans, W. K.; Choy, H.; Desjardins, P.; Esparaz, B. T.; Truong, M. T.; Saxman, S.; Kelaghan, J.; Bleyer, A.; Fisch, M. J. J. Natl. Cancer I. 2010, 102, 859.
64. Shojaei, F. Cancer Lett 2012, 320, 130.
65. De Jong, W. H.; Borm, P. J. A. Int. J. Nanomed. 2008, 3, 133.
66. LaVan, D. A.; McGuire, T.; Langer, R. Nat. Biotechnol. 2003, 21, 1184.
67. Pan, Y. L.; Ding, H.; Qin, L.; Zhao, X. X.; Cai, J. Y.; Du, B. J. Biomed. Nanotechnol. 2013, 9, 1746.
68. Song, H. Y.; Wang, W. B.; Zhao, P.; Qi, Z. T.; Zhao, S. H. Nanoscale 2014, 6, 3206.
69. Jo, D. H.; Kim, J. H.; Son, J. G.; Song, N. W.; Kim, Y. I.; Yu, Y. S.; Lee, T. G.; Kim, J. H. Nanomed.-Nanotechnol. 2014, 10, 1109.
70. Baharara, J.; Namvar, F.; Mousavi, M.; Ramezani, T.; Mohamad, R. Molecules 2014, 19, 13498.
71. Hermann, T.; Patel, D. J. Science 2000, 287, 820.
72. Zhang, Q.; Sun, X. Y.; Watt, E. D.; Al-Hashimi, H. M. Science 2006, 311, 653.
73. Hasegawa, H.; Sode, K.; Ikebukuro, K. Biotechnol. Lett. 2008, 30, 829.
74. Hasegawa, H.; Taira, K. I.; Sode, K.; Ikebukuro, K. Sensors 2008, 8, 1090.
75. Kaur, H.; Yung, L. Y. L. Plos One 2012, 7, e31196
76. Nonaka, Y.; Sode, K.; Ikebukuro, K. Molecules 2010, 15, 215.
77. Nonaka, Y.; Yoshida, W.; Abe, K.; Ferri, S.; Schulze, H.; Bachmann, T. T.; Ikebukuro, K. Anal. Chem. 2013, 85, 1132.
78. Ruckman, J.; Green, L. S.; Beeson, J.; Waugh, S.; Gillette, W. L.; Henninger, D. D.; Claesson-Welsh, L.; Janjic, N. J. Biol. Chem. 1998, 273, 20556.
79. Ferrara, N.; Gerber, H. P.; LeCouter, J. Nat. Med. 2003, 9, 669.
80. Ng, E. W.; Shima, D. T.; Calias, P.; Cunningham, E. T., Jr.; Guyer, D. R.; Adamis, A. P. Nat. Rev. Drug Discov. 2006, 5, 123.
81. Bradley, J.; Ju, M.; Robinson, G. S. Angiogenesis 2007, 10, 141.
82. Biesecker, G.; Dihel, L.; Enney, K.; Bendele, R. A. Immunopharmacology 1999, 42, 219.
83. Levine, A. M.; Quinn, D. I.; Gorospe, G.; Lenz, H. J.; Tulpule, A. Journal of Clinical Oncology 2004, 22, 197.
84. You, X. G.; Tu, R.; Peng, M. L.; Bai, Y. J.; Tan, M.; Li, H. J.; Guan, J.; Wen, L. J. Contrast Media Mol. Imaging 2014, 9, 349.
85. Krock, B. L.; Skuli, N.; Simon, M. C. Genes cancer 2011, 2, 1117.
86. Carmeliet, P.; Dor, Y.; Herbert, J. M.; Fukumura, D.; Brusselmans, K.; Dewerchin, M.; Neeman, M.; Bono, F.; Abramovitch, R.; Maxwell, P.; Koch, C. J.; Ratcliffe, P.; Moons, L.; Jain, R. K.; Collen, D.; Keshert, E. Nature 1998, 395, 525.
87. Murukesh, N.; Dive, C.; Jayson, G. C. Brit. J. Cancer 2010, 102, 8.
88. Demers, L. M.; Ostblom, M.; Zhang, H.; Jang, N. H.; Liedberg, B.; Mirkin, C. A. J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 11248.
89. Lu, W.; Wang, L.; Li, J.; Zhao, Y.; Zhou, Z.; Shi, J.; Zuo, X.; Pan, D. Sci. Rep. 2015, 5, 10158.
90. Jang, N. H. B. Kor. Chem. Soc. 2002, 23, 1790.
91. Pei, H.; Li, F.; Wan, Y.; Wei, M.; Liu, H. - J.; Su, Y.; Chen, N.; Huang, Q.; Fan, C. - H. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 11876.
92. Chen, N.; Wei, M.; Sun, Y.; Li, F.; Pei, H.; Li, X.; Su, S.; He, Y.; Wang, L.; Shi, J.; Fan, C.; Huang, Q. Small 2014, 10, 368.
93. Shiang, Y. - C.; Hsu, C. - L.; Huang, C. - C.; Chang, H. - T. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2011, 50, 7660.
94. Hsu, C. - L.; Wei, S. - C.; Jian, J. - W.; Chang, H. - T.; Chen, W. - H.; Huang, C. - C. Rsc Adv. 2012, 2, 1577.