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研究生:張宏安
研究生(外文):Hung-An Chang
論文名稱:利用即時聚合酶連鎖反應鑑定旗魚種類
論文名稱(外文):Identification of billfish (Xiphiidae, Istiophoridae) species by a real-time PCR technique
指導教授:蕭仁傑蕭仁傑引用關係
口試委員:陳韋仁江偉全
口試日期:2015-06-29
學位類別:碩士
校院名稱:國立臺灣大學
系所名稱:海洋研究所
學門:自然科學學門
學類:海洋科學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2015
畢業學年度:103
語文別:中文
論文頁數:75
中文關鍵詞:旗魚物種鑑定即時聚合酶連鎖反應
外文關鍵詞:billfishspecies identificationreal-time PCR
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旗魚為世界上許多國家重要的經濟性魚種,可加工製成各式產品,如生魚片、魚鬆、魚筋、魚醬等。這些產品在臺灣市面上販售時,成分皆僅標註為旗魚,因此對於旗魚製品進行物種的鑑定,將有助於保育與漁業資源管理。在本研究中,我們發展了一套利用即時聚合酶連鎖反應的方法鑑定六個旗魚物種,分別為劍旗魚 (Xiphias gladius)、雨傘旗魚 (Istiophorus platypterus)、立翅旗魚 (Istiompax
indica)、紅肉旗魚 (Kajikia audax)、黑皮旗魚 (Makaira nigricans)以及小吻四鰭旗魚 (Tetrapturus angustirostris)。我們共設計了14 條引子,包含12 條物種專一性引子及2 條能區分六種旗魚與非旗魚物種的universal primer。結果顯示12 條引子對六種旗魚具有良好的鑑別能力,目標物種的ΔCt value 皆介於 -2.23 ~ 3.93 之間,極限濃度可達0.4 ng/μL。此外,為節省檢驗的成本與步驟,我們進一步將多組引子於同一個PCR 反應中進行測試,結果顯示六種旗魚能根據MCA 來鑑別,每個物種皆具有專一性的Tm value:X. gladius:Tm1 = 75.0 ± 0.0 °C, Tm2 = 83.5 ± 0.0 °C;I. platypterus:Tm1 = 75.2 ± 0.3 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.2 °C;I. indica:Tm1 = 77.5 ± 0.0 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.0 °C;K. audax:Tm = 80.5 ± 0.0 °C;M. nigricans:Tm1 = 76.0 ± 0.0 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.0 °C;T. angustirostris:Tm = 77.0 ± 0.0 °C。根據我們的研究結果可建立出一套鑑定六個旗魚物種的流程。此方法具有高效率、高靈敏度,進行高通量檢測時成本較低,我們預期此方法將有助於掌握漁業資源與保障消費者權益。

Billfish is an important fishery resource all over the world, and is usually marketed as sashimi, filleted, fish floss and sauce. Most billfish products in Taiwan were only labeled with “billfish” in their ingredients. Therefore, species identification of the billfish products is necessary and will benefit the conservation and regulation of these fishery resourcs. In this study, we developed a real-time PCR approach to identify the six billfish species:Swordfish (Xiphias gladius), Sailfish (Istiophorus platypterus), Black marlin (Istiompax indica), Striped marlin (Kajikia audax), Blue marlin (Makaira nigricans) and Shortbill spearfish (Tetrapturus angustirostris). The whole system contained 14 primers, including 12 species-specific primers and two universal primers designed for discriminating the six billfish from non-billfish species. The 12 species-specific primers showed clear discrimination among the six billfish species, with ΔCt values of the target species ranging between -2.23 ~ 3.93 and the limit of detection is 0.4 ng/μL. In order to minimize the cost and time of whole identification system, we also tested the applicability of the multiplex qPCR by combining several species-specific primers in a single reaction to identify the species. The result showed that the six species can be identified according to the melting curve pattern and Tm values for X. gladius: Tm1 = 75.0 ± 0.0 °C, Tm2 = 83.5 ± 0.0 °C, I. platypterus:Tm1 = 75.2 ± 0.3 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.2 °C, I. indica:Tm1 = 77.5 ± 0.0 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.0 °C, K. audax:Tm = 80.5 ± 0.0 °C, M. nigricans:Tm1 = 76.0 ± 0.0 °C, Tm2 = 80.5 ± 0.0 °C, T. angustirostris:Tm = 77.0 ± 0.0 °C. An identification protocol for the six billfish species was established in this study. The methods is efficient, sensitive, and cheaper than other conventional methods, which will be helpful for fishery management and protecting the consumer’s rights.

致謝 I
中文摘要 II
Abstract III
目錄 IV
圖目錄 V
表目錄 VII
附錄 VIII
壹、前言 1
1.1. 研究對象 1
1.2. 旗魚產品的類型與製作流程 2
1.3. 魚類產品鑑種的重要性 3
1.4. 利用基因序列鑑種 3
1.5. 研究目的 7
貳、材料與方法 8
2.1. 樣本採集與DNA萃取 8
2.2. 基因序列資料庫的建立 9
2.3. 及時聚合酶鏈鎖反應條件 9
2.4. 各引子專一性與極限濃度檢測 10
2.5. 食品樣本的測試 10
2.6. 資料分析與物種判讀方法 10
參、結果 11
3.1. 序列資料庫建立與SNP分析 11
3.2. 物種專一性引子的設計 11
3.3. Real-time PCR 反應條件測試 12
3.4. 引子的極限濃度測試與繪製標準曲線 14
3.5. Melting curve analysis 應用於物種鑑定 14
3.6. 未知樣本的鑑定流程 15
3.7. 食品樣本的檢測 16
肆、討論 18
4.1. 萃取DNA方法比較 18
4.2. 專一性引子的設計與檢測 18
4.3. 專一性引子的定性分析 20
4.4. Multiplex Real-time PCR的檢測 21
4.5. 食品樣本的檢測 22
4.6. ΔCt與Tm值檢測方法的比較與適用範圍 24
伍、結論 26
陸、參考文獻 27
圖目錄
圖 1 以Kimura 2 Parameters (K2P) model與Maximum likelihood (ML)方法對六個旗魚物種繪製親緣關係樹。 30
圖 2 利用UF + UR對旗魚物種與非旗魚物種進行及時聚合酶鏈鎖反應。 31
圖 3利用對劍旗魚具物種專一性的引子:XF + XR對劍旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 31
圖 4 利用對黑皮旗魚具物種專一性的引子:MnF + IiR1對黑皮旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 32
圖 5利用對小吻四鰭旗魚具物種專一性的引子:TaF + TaR對小吻四鰭旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 32
圖 6利用對紅肉旗魚具物種專一性的引子:KaF + KaR對紅肉旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 33
圖 7利用對立翅旗魚具物種專一性的第一組引子:APIF + IiR1對立翅旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 33
圖 8利用對立翅旗魚具物種專一性的第二組引子:IiF2 + IiR2對立翅旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 34
圖 9利用對雨傘旗魚具物種專一性的引子:APIF + IpR對雨傘旗魚與另外五種旗魚進行及時聚合酶鏈鎖反應。 34
圖 10 利用XF + XR引子對六個濃度梯度的劍旗魚樣本進行檢測 35
圖 11利用MnF + IiR1引子對六個濃度梯度的黑皮旗魚樣本進行檢測。 35
圖 12利用TaF + TaR引子對六個濃度梯度的小吻四鰭旗魚樣本進行檢測。 36
圖 13利用KaF + KaR引子對六個濃度梯度的紅肉旗魚樣本進行檢測。 36
圖 14利用PIF + IiR1引子對六個濃度梯度的雨傘旗魚樣本進行檢測。 37
圖 15利用IiF2 + IiR2引子對六個濃度梯度的立翅旗魚樣本進行檢測。 37
圖 16利用PIF + IpR引子對六個濃度梯度的雨傘旗魚樣本進行檢測。 38
圖 17 七組引子的標準曲線及其效率。 39
圖 18 利用七組專一性引子分別對六種旗魚進行Melting curve analysis。 40
圖 19 將三組專一性不足的引子 (PIF + IpR、PIF + IiR1、IiF2 + IiR2)分別對其能增幅的物種進行Melting curve analysis。 41
圖 20對六個物種進行multiplex real-time PCR所得到的Melting curve。 42
圖 21 對第一類型食品進行multiplex real-time PCR所得到的Melting curve。 43
圖 22對第二類型食品進行multiplex real-time PCR所得到的Melting curve。 44
圖 23 UF、UR 引子的序列。 45
圖 24 XF、XR 引子的序列。 46
圖 25 MnF、IiR1 引子的序列。 47
圖 26 TaF、TaR引子的序列。 48
圖 27 KaF、KaR引子的序列。 49
圖 28 PIF、IiR1引子的序列。 50
圖 29 PIF、IpR引子的序列。 51
圖 30 IiF2、IiR2 引子的序列。 52
圖 31 小吻四鰭旗魚在ND2 基因片段上的兩種序列。 53
表目錄
表 1 六種旗魚物種與鮪魚、鯊魚的新鮮樣本採集。 54
表 2 食物製品的樣本採集。 54
表 3 自NCBI取得六種旗魚物種16S基因的Accession number。 55
表 4自NCBI取得六種旗魚物種cytb基因的Accession number。 55
表 5自NCBI取得六種旗魚物種COI基因的Accession number。 56
表 6自NCBI取得六種旗魚物種ND2基因的Accession number。 56
表 7自NCBI取得六種旗魚物種mtDNA全長序列的Accession number。 57
表 8 針對六種旗魚物種的三個基因設計引子進行定序。 57
表 9 cytb 基因在六個旗魚物種之間的序列差異。 58
表 10 COI基因在六個旗魚物種之間的序列差異。 59
表 11 ND2基因在六個旗魚物種之間的序列差異。 60
表 12 16S基因在六個旗魚物種之間的序列差異。 64
表 13 Universal 引子與物種專一性引子的序列、Tm值與片段長度。 65
表 14 利用UF、UR引子對六個旗魚物種與其他物種進行qPCR所得的Ct值。 65
表 15 利用物種專一性引子 (XF + XR、KaF + KaR、MnF + IiR1 、TaF + TaR)對六個旗魚物種進行qPCR並計算ΔCt值。 66
表 16利用物種專一性引子對六個旗魚物種進行qPCR並計算ΔCt值。 67
表 17 極限濃度測試。 68
表 18 利用UF、UR引子對13個食品樣本進行qPCR所得的Ct值。 69
表 19利用物種專一性引子對13個食品樣本進行qPCR並計算ΔCt值。 70
表 20 食品樣本依據檢測結果推測可能含有的旗魚物種成分 。 71 
附錄
附錄 1 2003~2013年全臺灣的旗魚產值及捕獲量 72
附錄 2 魚鬆製作流程 73
附錄 3 利用uMelt軟體對APIF+IpR引子增幅的產物進行解離曲線預測 74
附錄 4 對未知樣本進行鑑種的標準流程 75




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