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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:林俊星
研究生(外文):Chun-Hsing Lin
論文名稱:液態培養納豆菌生產納豆激酶之研究
論文名稱(外文):Study on the production of nattokinase by submerged culture of Bacillus subtilis
指導教授:楊芳鏘楊芳鏘引用關係
指導教授(外文):Fan-Chiang Yang
口試委員:黃進發徐榜奎
口試日期:2015-07-16
學位類別:碩士
校院名稱:東海大學
系所名稱:化學工程與材料工程學系
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2015
畢業學年度:103
語文別:中文
論文頁數:70
中文關鍵詞:納豆菌納豆激酶液態培養
外文關鍵詞:Bacillus subtilisnattokinasesubmerged culture
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摘要
本研究從市售產品「納豆發酵物(含納豆激酶)」中篩選出可生產納豆激酶的菌株,由液態搖瓶培養納豆菌生產納豆激酶。利用三角瓶實驗探討不同接種量、碳源濃度、氮源濃度、溶氧量、轉速等對生產納豆激酶之影響,提高納豆激酶之酵素活性並得到納豆菌生產納豆激酶之最佳培養條件。實驗結果顯示:接種量10% (v/v),培養基組成成分為4%麥芽糊精、4%黃豆粉、0.1% Peptone、0.01% K2HPO4、0.05% MgSO4.7H2O,在溫度37℃、180 rpm的條件下進行培養,經發酵培養120小時之後得到最高酵素活性值134.38 FU/mL。
以5公升發酵槽培養,探討不同攪拌速度、培養基濃度、饋料批式操作、pH控制等對生產納豆激酶之影響。實驗結果得知:培養基組成成分為8%麥芽糊精、8%黃豆粉、0.1% Peptone、0.01% K2HPO4、0.05% MgSO4.7H2O為培養基,種菌接種10%、溫度37℃、通氣量2vvm、攪拌速率700 rpm、起始pH值6.5、培養體積為2公升,培養8小時後可達到最高酵素活性,其酵素活性為243.75 FU/mL,產率比三角瓶培養高出近30倍。本實驗結果希望能作為放大生產的參考依據。
Abstract
A strain of Bacillus subtilis was isolated from a commercial natto extract product for nattokinase production. Shake flask cultures were carried out to investigate the effect of inoculums size, carbon source and nitrogen source concentrations, dissolved oxygen and rotating speed on the production of nattokinase. The medium was determined to be made up of 4% maltodextrin, 4% soybean flour, 0.1% peptone, 0.01% K2HPO4, 0.05% MgSO4.H2O. The results indicated that the nattokinase activity in shake flask cultures reached the highest level of 134.38 FU/mL in 120 h under the operating conditions of initial pH 6.5, 37℃, 180 rpm and 10% inoculums size.
A 5L stirred tank fermentor was used to study the effect of carbon and nitrogen concentration, aeration and rotating speed on the production of nattokinase. Moreover, the operating modes of fed-batch and pH control were also tested. The results indicated that when the concentrations of carbon and nitrogen were raised twofold, the highest activity of nattokinase of 243.75 FU/mL was obtained in 8 h under the operating conditions of 37℃, 2 vvm and 700 rpm, respectively. Compared with the data of flask cultures, the production yield had a 30 times increase. The results obtained in this study were expected to be a reference for commercial production.
摘要 .......................................................................................................... I
Abstract ................................................................................................... II
誌謝 ........................................................................................................ III
目錄 ........................................................................................................ IV
表目錄 .................................................................................................. VIII
圖目錄 .................................................................................................... IX
第一章 前言 ........................................................................................... 1
第二章 文獻回顧 ................................................................................... 3
2.1 納豆簡介 .................................................................................. 3
(一)納豆的歷史 ....................................................................... 3
(二)納豆的生產方法 ............................................................... 3
(三)營養成分 ........................................................................... 4
2.2 納豆菌與納豆激酶簡介 ........................................................... 5
(一)納豆菌 ............................................................................... 5
(二)納豆激酶 ........................................................................... 5
2.3 食用納豆生理功能 ................................................................... 7
(一)納豆激酶與血栓溶解 ........................................................ 7
(二)其他生理功能 ................................................................. 10
2.4 影響納豆激酶生產之液態發酵條件 ...................................... 14
(一)營養因子 ......................................................................... 14
(二)環境操作因子 ................................................................. 15
第三章 材料與方法............................................................................ 17
3.1 實驗材料 ................................................................................ 17
(一)實驗菌種 ......................................................................... 17
(二)實驗藥品 ......................................................................... 17
3.2 實驗儀器 ................................................................................ 19
3.3 實驗流程 ................................................................................ 20
(一)菌種篩選 ......................................................................... 20
(二)搖瓶培養試驗 ................................................................. 21
(三)五公升發酵槽培養試驗 .................................................. 22
3.4 實驗方法 ................................................................................ 22
(一)分離菌種 ......................................................................... 22
(二)菌種的保存及活化 .......................................................... 23
(三)種菌與發酵培養基 .......................................................... 23
(四)種菌培養試驗 ................................................................. 24
(五)搖瓶培養試驗 ................................................................. 25
(六)五公升發酵槽擴大培養條件探討 .................................. 27
3.5 納豆激酶活性(FU/mL)測試 .................................................... 28
(一)測試試劑 ......................................................................... 28
(二)測試原理 ......................................................................... 29
(三)測試步驟 ......................................................................... 29
第四章 結果與討論 ............................................................................. 33
4.1 菌種分離與種菌培養 ............................................................. 33
4.2 搖瓶培養試驗 ......................................................................... 38
(一)不同接種量之影響 .......................................................... 38
(二)不同碳源濃度的影響 ...................................................... 39
(三)不同氮源濃度的影響 ...................................................... 41
(四)不同溶氧量的影響 .......................................................... 42
(五)不同轉速的影響 ............................................................. 43
(六)Fed-batch試驗 ................................................................ 45
(七)搖瓶最佳培養條件 .......................................................... 46
4.3 五公升發酵槽培養試驗 ......................................................... 49
(一) 攪拌速率之影響............................................................ 49
(二) 碳、氮源濃度之影響 .................................................... 55
(三) 控制pH值之影響 ......................................................... 58
(四) Fed-batch操作試驗 ........................................................ 60
(五) 五公升發酵槽最佳結果與比較 .................................... 61
(六) 搖瓶與五公升發酵槽之結果比較 ................................ 63
第五章 結論與未來展望 ...................................................................... 64
5.1 結論 ........................................................................................ 64
5.2 未來展望 ................................................................................ 66
參考文獻 ...............................................................................................67

表目錄
表3-1 實驗藥品清單 ........................................................................... 17
表3-2 實驗儀器清單 ........................................................................... 19
表3-3 培養基列表 ............................................................................... 24
表4-1種菌培養時間的OD600nm比較 ................................................... 35
表4-2 不同種菌氮源及濃度 ................................................................ 37
表4-3 研究與文獻比較 ....................................................................... 49
表4-4 不同轉速對產率之影響 ............................................................ 51
表4-5 五公升發酵槽最佳結果與比較 ................................................ 62
表4-6 五公升發酵槽產率比較 ............................................................ 63
表4-7 搖瓶與五公升發酵槽之結果比較 ............................................ 63

圖目錄
圖2.1 納豆激酶之ㄧ級結構[12] ........................................................... 7
圖2.2 納豆激酶在血栓溶解系統中之直接與間接作用[1] ................. 10
圖3.1 菌液與甘油於微量離心管中 .................................................... 23
圖3.2 納豆激酶活性測試流程圖 ........................................................ 32
圖4.1 納豆分離菌株於牛奶培養基之照片 ........................................ 33
圖4.2 納豆分離菌株於NA培養基之照片.......................................... 34
圖4.3 納豆分離菌株之菌體顯微照片(×500) ...................................... 34
圖4.4 不同種菌培養時間對酵素活性的影響 ..................................... 36
圖4.5 不同種菌成分對酵素活性的影響 ............................................ 38
圖4.6 不同接種量對酵素活性的影響 ................................................ 39
圖4.7 不同碳源濃度影響 .................................................................... 40
圖4.8 不同氮源濃度之影響 ................................................................ 42
圖4.9 不同溶氧量的影響 .................................................................... 43
圖4.10 不同轉速的影響 ...................................................................... 44
圖4.11 Fed-batch搖瓶試驗 .................................................................. 46
圖4.12 最佳搖瓶條件之酵素活性 ...................................................... 48
圖4.13 五公升發酵槽轉速改變對納豆激酶活性的影響 ................... 50
圖4.14 五公升發酵槽不同轉速對酵素活性之影響(300 rpm) ........... 53
圖4.15 五公升發酵槽不同轉速對酵素活性之影響(500 rpm) ........... 54
圖4.16 五公升發酵槽不同轉速對酵素活性之影響(700 rpm) ........... 55
圖4.17 五公升發酵槽不同碳、氮源濃度對酵素活性之影響(6%) .... 57
圖4.18 五公升發酵槽不同碳、氮源濃度對酵素活性之影響(8%) .... 58
圖4.19 控制pH值對納豆激酶活性之影響 ........................................ 59
圖4.20 Fed-batch試驗 ......................................................................... 61
參考文獻
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