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研究生:郭玲瑜
研究生(外文):Ling-Yu Guo
論文名稱:功能化二氧化矽纖維材料的製備及其於組織工程之應用
論文名稱(外文):Preparation of Functionalized Silica Nanofiber Materials for Tissue Engineering Application
指導教授:陳玉惠陳玉惠引用關係
指導教授(外文):Yui-Whei Chen
學位類別:碩士
校院名稱:中原大學
系所名稱:化學研究所
學門:自然科學學門
學類:化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2016
畢業學年度:104
語文別:中文
論文頁數:115
中文關鍵詞:靜電紡絲奈米纖維層黏連蛋白大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞組織工程
外文關鍵詞:EletrospinningNanofiberLamininPC12 CellsTissue Engineering
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現今醫學技術雖然進步,但對於神經損傷所造成的神經疾病仍然沒有很好的治療方法,因此創造出一個適合神經細胞生長的環境與加速修復受損的神經組織,一直是醫學領域當中的重要課題。
本實驗室先前以靜電紡絲技術製備二氧化矽奈米纖維基材SNFR1,期望製備出適合細胞生長、貼附與長時間分化的生物基材,期望未來能應用於體內移植材料。然而本先前所製備的SNFR1,在PBS溶液底下具有快速降解的問題,因此本研究的方向將針對(1) 以改變前趨液的配方,製備出更穩定的二氧化矽纖維基材SNFR2,並初步以SEM、CA、BET、TGA、NMR及FTIR進行材料物理化學性質的探討;(2) 將SNFR2以物理吸附 (SNFR2/L) 與化學接枝 (SNFR2-AP/S/L) 兩種固定化層粘連蛋白 (laminin) 的方式進行修飾,接著將上述經laminin修飾後的基材分別浸泡於PBS溶液與細胞培養液中,進行長時間基材穩定性及laminin與基材結合鍵結能力的測試與分析;(3) 最後以大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞株 (PC 12 cells) 為細胞模式,探討以不同結合方式修飾laminin於基材,對PC 12細胞貼附、存活與長時間分化能力等影響。
研究結果顯示,在材料鑑定的部分利用NMR已成功地證實SNFR2 (交聯程度91.8%)比先前的SNFR1 (交聯程度76.2%) 更具結構穩定性,再者經細胞培養液降解測試發現,以化學鍵結方式修飾之SNFR2-AP/S/L相較於物理塗佈方式修飾之SNFR2與SNFR2/L,可由免疫螢光染色可證實,其laminin的結合鍵結能力較強且長達18天。另外由Cell-SEM圖得知,SNFR2-AP/S/L加入神經生長因子 (Nerve growth factor) 後,PC12細胞分化出來的神經突長 (neurite)會沿著纖維進行分化生長達十八天之久,其他組別則在十二天後死亡。由上述結果得知利用化學接枝修飾laminin的基材 (SNFR2-AP/S/L) 相當適合作為長時間體內移植的生物基材,並應用於神經組織工程上。


Although medical technology is quite advanced today, but it is still lack the good treatments for repairing the nerve damage caused by the neurological diseases. Thus, preparing a suitable environment for the growth of nerve cells to accelerate repairing of the damaged nerve tissue has been an important issue in the medical research field.
Our previous study has successfully fabricated the silica nanofiber, SNFR1, by the electrospinning technique to be used as implant biomaterials in vivo, improving cell attachment, adhesion and long-term differentiation. However, SNF-R1 was found to be degraded too rapidly in the PBS solution and unsuitable for the long-term application. Therefore, the aim of this study includes three parts: (1) to fabricate more stable material SNFR2 by modifying the composition of the precursor solution and examine its physicochemical properties by the measurements of scanning electron microscope, contact angle, nitrogen adsorption/desorption isotherms, thermogravimetric analysis, nuclear magnetic resonance spectrometer and Fourier transform infrared, (2) to modify the surface of SNFR2 with laminin by either physical absorption method or chemical modification method. The as-modified SNFR2 materials, SNFR2/L andSNFR2-AP/S/L, were examined their long-term stability and binding ability between laminin and substrates in PBS solution and cell culture medium, separately, (3) to use neuron-like rat pheochromocytoma, PC12, as the cell line to study the effect of SNFR2/L andSNFR2-AP/S/L on their properties of adhesion, survival and long-term differentiation.
The NMR results showed that the crosslinking percentage was increased from 76.2% of SNFR1 to 91.8% of SNFR2, providing better stability. The result of the investigation of the degradation of laminin on the modified SNF surfaces by the immunocytochemistry using anti-laminin antibody indicated that after 18 days, the physical adsorbed SNFR2-L was completely degraded, while the chemically modified SNFR2-AP/S/L was not degraded. In the cell morphology test, it was found that after addition of the nerve growth factor for 18 days, the PC12 cells on SNFR2-AP/S/L substrate differentiated into much longer neurites than on the other substrates, Our study demonstrated that the chemically modified substrate, SNFR2-AP/S/L, provided a better alternative than the unmodified SNF substrate for the long-term implant biomaterials to apply on neural tissue engineering.


目錄

摘要 I
Abstract III
謝誌 V
目錄 VI
圖目錄 X
表目錄 XIII
第一章 緒論 14
1-1 前言 14
1-2 生醫材料 15
1-2-1 生醫材料的簡介 15
1-2-2 生醫材料的條件 16
1-3 二氧化矽(Silica, SiO2) 17
1-3-1 二氧化矽的簡介 17
1-3-2 奈米二氧化矽於生醫材料應用 18
1-3-3 以溶膠-凝膠法製備二氧化矽孔洞材料 19
1-4 靜電紡絲概論 24
1-4-1 靜電紡絲的起源與相關研究 24
1-4-2 靜電紡絲之原理 25
1-4-3 靜電紡絲基本組成介紹 26
1-4-4 影響靜電紡絲之參數 30
1-4-4-1 聚合物參數對纖維型態的影響 32
1-4-4-2 溶劑參數對纖維型態的影響 35
1-4-4-3 溶液參數對纖維型態的影響 36
1-4-4-4 控制參數對纖維型態的影響 39
1-5 組織工程 43
1-5-1 仿生支架與細胞外基質 45
1-5-2 訊息因子與層粘連蛋白(laminin)概論 48
1-6 神經系統 50
1-6-1 大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤(Rat Adrenal Medulla Pheochromocytoma, PC12)簡介 51
第二章 理論背景與文獻回顧 52
2-1 靜電紡絲技術製備二氧化矽應用於生醫材料之研究 52
2-2 經修飾作用後的支架材料於組織工程之應用 56
2-3 研究動機與目的 60
第三章 材料與方法 61
3-1藥品與試劑 61
3-2儀器設備 63
3-2-1實驗儀器 63
3-2-2分析儀器 64
3-3實驗架構 65
3-3-1 實驗流程圖 65
3-3-2 修飾二氧化矽奈米纖維之化學反應機制 66
3-4實驗步驟 67
3-4-1紡絲前驅溶液的配置 67
3-4-2製備二氧化矽奈米纖維材料 67
3-4-3以化學與物理方法進行表面修飾的二氧化矽纖維材料 67
3-4-4二氧化矽奈米纖維之降解試驗 68
3-4-5二氧化矽奈米纖維之免疫螢光染色 68
3-4-6 PC12細胞的培養 69
3-4-7 細胞免疫螢光染色 69
3-4-8 Live/Dead Viability 細胞貼附性與存活率測試 70
3-4-9 Cell-SEM分析-基材上細胞型態觀察 70
3-5鑑定儀器之原理與條件 71
3-5-1 表面結構觀察-場發射掃描式電子顯微鏡 (FE-SEM) 71
3-5-2自動接觸角分析儀(Contact Angle Analysis) 72
3-5-3孔洞及表面積分析儀 (Surface Area and Pore Analyzer) [90] [91] 73
3-5-4 傅立葉轉換紅外線光譜儀(FT-IR) 76
3-5-5熱重分析儀(TGA) 77
3-5-6細胞型態的觀察-光學顯微鏡觀察 78
第四章 結果與討論 79
4-1先前研究成果與現今研究之比較 79
4-2經修飾後二氧化矽奈米纖維之鑑定 81
4-2-1傅立葉轉換紅外線光譜分析(FT-IR) 81
4-2-2熱重損失分析(TGA) 82
4-2-3固態核磁共振分析(Solid state29Si-NMR) 83
4-3二氧化矽奈米纖維固定化層粘連蛋白(laminin) 85
4-3-1二氧化矽奈米纖維表面修飾與固定化層粘連蛋白(laminin) 85
4-3-1傅立葉轉換紅外線光譜分析(FT-IR) 86
4-3-2掃描式電子顯微鏡(SEM)與親疏水性之分析(CA) 88
4-3-3孔洞及比表面積分析(Surface Area and Pore Analyzer) 90
4-3-4材料免疫螢光染色分析(IFA) 92
4-3-5材料免疫螢光染色參數測試 93
4-4經修飾後二氧化矽基材降解測試 94
4-4-1經修飾後二氧化矽基材於PBS緩衝溶液之掃描式電子顯微鏡(SEM) 94
4-4-2經修飾後二氧化矽基材於PBS緩衝溶液之材料免疫螢光染色(IFA) 96
4-4-3經修飾後二氧化矽基材於細胞培養液之掃描式電子顯微鏡(SEM) 98
4-4-4經修飾後二氧化矽基材於細胞培養液之材料免疫螢光染色(IFA) 100
4-5 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材之應用探討 102
4-5-1 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材貼附測試 102
4-5-2 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材存活率測試 103
4-5-3 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材分化測試之光學顯微鏡 104
4-5-4 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材分化測試之掃描式電子顯微鏡(SEM) 106
4-5-5 PC12細胞於修飾後二氧化矽基材分化測試之細胞免疫螢光染色(IFA) 108
第五章 結論 110
未來展望 111
參考文獻 113


圖目錄
圖 1、周邊神經受損 14
圖 2、生醫材料的種類 15
圖 3、理想的生醫材料之條件 16
圖 4、二氧化矽結構 17
圖 5、溶膠凝膠法 20
圖 6、不同PH值之水解縮合反應速率 22
圖 7、不同催化劑所呈現的成交結構型態 22
圖 8、液滴表面受電場作用形成之圓錐狀 25
圖 9、靜電紡絲示意圖 26
圖 10、靜電紡絲的各式針頭 27
圖 11、用同軸靜電紡絲製備殼核結構纖維 27
圖 12、天然性高分子膠原蛋白奈米纖維之SEM圖 32
圖 13、合成性高分子PLA奈米纖維之SEM圖 33
圖 14、(A) 醋酸鋁與PVP之無機複合奈米纖維 (B) 鍛燒後之醋酸鋁無機奈米纖維SEM圖 33
圖 15、不同分子量的PVA(A) 9000~13000 g/ mol (B) 13000~23000 g/ mol (C) 31000~50000 g/ mol之SEM圖 34
圖 16、黏度對纖維型態之影響 37
圖 17、溶液濃度對其黏度與電紡後的纖維直徑大小之影響 37
圖 18、不同電場下(kV/cm) (a) 1 , (b, c) 2 , (d, e) 3, (f) 4.5, (g, h) 5, (i) 9 的殼聚糖纖維之SEM圖 39
圖 19、流速對纖維形態之影響 40
圖 20、不同工作距離下(a)7.5cm (b)20cm 的明膠纖維之SEM圖 41
圖 21、不同相對濕度下(a) 50% (b) 30% (c) 20% 的PS奈米纖維之SEM圖 42
圖 22、組織工程示意圖 43
圖 23、 組織工程的三要素 44
圖 24、細胞外基質的組成構造 48
圖 25、層黏連蛋白的結構示意圖 49
圖 26、神經突起分支構造,並且末端聚集許多小囊泡 51
圖 27、實驗架構圖 65
圖 28、反應機制圖 66
圖 29、氣 液 固界面張力之間平衡 72
圖 30、接觸角量測示意圖 72
圖 31、氮氣吸脫附曲線圖 75
圖 32、單階段反應的TG曲線特徵 77
圖 33、光學顯微鏡 78
圖 34、SNFR1於PBS中降解型態之光學顯微鏡圖 79
圖 35、表面官能化二氧化矽奈米纖維之FT-IR圖 81
圖 36、表面官能化二氧化矽奈米纖維之TGA圖 82
圖 37、表面官能化的二氧化矽奈米纖維之29 Si-NMR圖。 83
圖 38、二氧化矽奈米纖維進行表面固定化修飾的示意圖 85
圖39、固定化laminin於二氧化矽奈米纖維之FT-IR圖 86
圖 40、表面修飾二氧化矽奈米纖維之SEM圖及接觸角量測圖。 89
圖 41、表面官能化的二氧化矽奈米纖維之氮氣吸/脫附曲線圖。 91
圖42、表面修飾二氧化矽奈米纖維之免疫螢光染色分析。 92
圖 43、SNFR2/L基材之材料免疫螢光染色。 93
圖 44、表面修飾二氧化矽奈米纖維於PBS溶液下降解行為之 SEM分析。 95
圖 45、表面修飾二氧化矽奈米纖維於PBS溶液下分析laminin含量變化。 97
圖 46、表面修飾二氧化矽奈米纖維於細胞培養液下降解行為分析之SEM圖。 99
圖 47、表面修飾二氧化矽奈米纖維於細胞培養液下分析laminin含量變化。 101
圖 48、PC12細胞貼附於SNFR2、SNFR2-AP/S/L及SNFR2/L基材上,四小時後之量化統計圖及螢光顯微鏡圖。 102
圖 49、PC12細胞於SNFR2、SNFR2-AP/S/L及SNFR2/L基材,24hr與72hr後之細胞存活率量化統計圖及螢光顯微鏡圖。 103
圖 50、PC12細胞於十八天後之貼附分化的光學圖。 105
圖 51、 PC12細胞於十八天後之貼附分化的SEM圖。 107
圖 52、利用免疫螢光染色法觀察神經細胞 (PC12 cell) 18天後的分化情形。 109
圖 53、二氧化矽結合重組融合蛋白(SB-RGD)修飾於二氧化矽生物基材之螢光與光學顯微鏡。 111
圖 54、片段纖維製備示意圖 112
圖 55、片段纖維之SEM圖 112


表目錄

表 1、靜電紡絲裝置中收集板的種類 28
表 2、靜電紡絲主要參數對纖維直徑和形貌的影響常態 31
表 3、支架材料表 46
表 4、近年來靜電紡絲應用於生醫材料之文獻 53
表 5、不同改質方法應用於組織工程之文獻 57
表 6、BET等溫吸附曲線的形式 74
表 7、SNFR1與SNFR2之基材鑑定比較 80
表 8、29Si-solid NMR分析基材鑑定數據 84
表 9、FT-IR之各官能基的吸收峰位置 87
表 10、纖維直徑與接觸角之數據 89
表 11、氮氣吸脫附儀之數據分析 90



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