臺灣博碩士論文加值系統

骨質疏鬆症是一種骨骼疾病，其特徵為低骨質密度與骨微結構的改變，使骨質脆度上升增加骨折風險。Akr1A1是小鼠維生素C合成路徑的重要基因，當其基因被剔除時會使氧化壓力、脂質過氧化與促炎性細胞激素上升，進而影響骨質代謝導致骨質疏鬆。過去研究發現克弗爾有調節膽固醇、預防心血管疾病、腸道菌叢改善、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、傷口癒合、免疫調節、抗過敏和骨質保健等功效，本實驗室自行產製的克弗爾使用去卵巢大鼠動物模式發現具有延緩骨質流失與增強骨微結構的效果。因此本實驗進一步使用Akr1A1基因剔除小鼠，模擬營養缺失型骨質疏鬆症動物模式，評估克弗爾對於Akr1A1基因剔除小鼠延緩骨質流失與骨微結構之功效。本試驗使用8周齡ICR公母鼠作為外對照組(1)正常對照組(WT/Control)；Akr1A1基因剔除公母鼠平均體重分組: (2)未預防對照組(H2O/Mock)；(3)克弗爾低劑量預防組(KL)；(4)克弗爾高劑量預防組(KH)；(5)維生素C預防組(Vit C)；(6)市售福善美組(ALN)，進行12周的管餵後犧牲，採集血液與骨頭樣本進行分析。結果顯示克弗爾會透過提升過氧化氫酶和超氧歧化酶活性來降低氧化壓力，調節RANKL/OPG骨質代謝，提升成骨細胞指標第一型前膠原蛋白氮端前胜鏈(P1NP)，降低破骨細胞指標第一型膠原蛋白碳端胜肽(CTX-1)。微電腦斷層掃描(Micro-CT)參數顯示克弗爾會提升骨小樑骨礦物密度(BMD)、骨體積比(Tb.BV/TV)和骨小樑數目(Tb.N)，降低骨小樑分離率(Tb.Sp)，參數結果與3D影像圖一致。此外，股骨骨髓中的成骨細胞數量在治療後顯著增加，但破骨細胞數量沒有。因此得出結論，跟臨床雙膦酸鹽藥物降低破骨細胞活性相反，克弗爾預防Akr1A1基因剔除小鼠骨質流失是透過提升成骨作用。

Osteoporosis is a skeletal disorder characterized by the loss of bone mass and the changes of bone structure and biochemical properties, predisposing individuals to an increased risk of fracture. A type of fermented dairy products prepared with kefir grains is rich in kefir-fermented peptides. In our previous studies, the benefits of kefir-fermented peptides in bone metabolism in growing, aged and ovariectomized rat models had been demonstrated. In this study, another model of osteoporosis, Akr1A1 gene knockout (KO) mice, was used to evaluate the osteoprotective effects of kefir-fermented peptides on osteoporosis induced by vitamin C deficiency. Forty-two 8-week old Akr1A1 KO mice used were divided into seven groups as (1) Mock: H2O; (2) KL: low-dose kefir (164 mg/kg/day); (3) KH: high-dose kefir (656 mg/kg/day); (4) Vit C: Vitamin C in drinking water (400 mg/L); (5) ALN: alendronate sodium (2.5 mg/kg/day); and six 8-week old ICR mice were used as normal control. Mice were sacrificed at 12 weeks post-treatment. The results demonstrated that the administration of kefir and kefir-fermented peptide can decrease oxidative stress by increasing the activities of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) as well as the level of procollagen type 1 (P1NP) and decreasing the level of C-terminal telopeptide-1 (CTX-1) as well as the ratio between RANKL and osteoprotegerin (RANKL/OPG). The µ-CT analysis indicated that the administration of kefir and kefir-fermented peptide have significantly improved the trabecular bone properties by increasing BMD, bone volume (Tb.BV/TV), bone number (Tb.N) and decreasing bone separation (Tb.Sp). These results were consistent with the reconstituted images of trabecular bone microarchitectures. Furthermore, the osteoblast number in femoral bone marrow significantly increased after treatment, but osteoclast number did not. We concluded that the present kefir preparation and its peptide derivatives can elicit an osteoprotective effect on vitamin C deficiency-induced osteoporosis on murine model, potentially due to the increase of osteoblast activity, in contrast to the reduction of osteoclast activity shown by clinical bisphosphonate drugs.

中文摘要………….………………………………….……..…………….i
Abstract……………….………………………………….……..….……ii
目錄………….………………………………….……..…………………iii
圖目錄………….………………………………….……..……………...vi
表目錄…….……...……….………………………………….……..…...ix
壹、緒論 1
貳、文獻探討 2
一、營養流行病學 2
(一)骨質疏鬆症流行病調查 2
(二)骨質疏鬆症之性別差異 2
二、與骨質疏鬆相關之營養素 9
(一)礦物質 9
(二)維生素 10
(三)蛋白質 11
三、骨質疏鬆症動物模式 15
(一)去卵巢動物模式(Ovariectomic animal model；OVX) 15
(二)遺傳型 15
(三)營養型 16
四、骨骼成分與結構 20
(一)成骨細胞(Osteoblast；OB) 20
(二)骨細胞(Osteocyte) 20
(三)破骨細胞 (Osteoclast；OC) 20
五、骨質疏鬆 23
(一)骨質疏鬆症危險因子 23
(二)骨質代謝血清因子生理意義 23
(三)骨質代謝細胞激素 25
(四)骨質代謝與氧化壓力 25
六、生物醫學影像與生物力學分析 33
(一)電腦微斷層掃描分析儀 (μ-CT) 33
(二)奈米壓痕測試分析儀 (NID) 33
七、克弗爾發酵乳之保健功效及應用 35
(一)克弗爾發酵乳功能與研究 35
(二)克弗爾胜肽 35
八、研究動機與策略 37
參、材料與方法 38
一、實驗動物之品系 38
二、實驗流程、餵食模式、動物犧牲及樣品取得 38
(一)實驗架構規劃 38
(二)動物模式建立 39
(三)動物試驗設計與分組 39
(四)管餵試驗材料之製備 39
(五)犧牲前預備 40
(六)動物犧牲與樣品採集 40
三、血液生化數值測定 43
(一)氧化壓力指標之測定 43
(二)促炎細胞激素指標之測定 44
(三)骨質代謝指標測定 45
四、細胞活性分析 47
(一)骨質-成骨細胞活性(Osteoblast activity)分析 47
(二)骨質-破骨細胞活性(Osteoclast activity)測試 48
五、微電腦斷層掃描分析 49
(一)骨質結構分析之靠近膝關節的遠端股骨骨小梁與皮質骨區域圈選計算方式 49
(二)股骨3D影像圖重組 49
六、奈米壓痕試驗 52
(一)試片冷鑲埋(Cold Mounting) 52
(二)試片研磨拋光 52
(三)分析方式 52
七、統計方法 54
肆、結果 55
一、克弗爾對於AKR1A1基因缺失小鼠體重與攝食量變化影響 55
二、克弗爾對於AKR1A1基因缺失小鼠血液生化數值影響 58
(一)ROS/RNS 58
(二)脂質過氧化 58
(三)抗氧化酵素 59
(四)促炎性細胞因子 59
(五)RANKL/OPG骨質代謝系統 60
(六)成骨細胞活性指標 60
(七)破骨細胞活性指標 61
三、克弗爾於營養缺乏型骨質疏鬆症AKR1A1缺失小鼠處理12週後，藉由微電腦斷層掃描分析儀評估延緩股骨骨小樑骨質流失之功效 82
(一)以微電腦斷層掃描分析儀重組股骨3D結構 82
(二)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑與組織所佔之比例 82
(三)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑厚度 82
(四)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑數目 83
(五)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑分離率 83
(六)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑之骨礦物密度 83
四、克弗爾於營養缺乏型骨質疏鬆症AKR1A1缺失小鼠處理12週後，藉由微電腦斷層掃描分析儀評估延緩股骨皮質骨骨質流失之功效 91
(一)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨骨體積 91
(二)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨與組織體積總佔比 91
(三)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨骨表面與骨體積所佔之比例 91
(四)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨骨礦物質密度 91
(五)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨直徑 92
(六)股骨皮質骨性別比較 92
五、克弗爾於營養缺乏型骨質疏鬆症AKR1A1缺失小鼠處理12週後，對骨質細胞活性之影響 100
(一)成骨細胞活性影響 100
(二)破骨細胞活性 100
六、克弗爾發酵胜肽對於AKR1A1基因缺失公鼠血液生化指標影響 114
(一)ROS/RNS 114
(二)脂質過氧化 115
(三)抗氧化酵素 115
(四)促炎性細胞激素 115
(五)骨質代謝系統 115
(六)成骨細胞活化指標 116
(七)破骨細胞活化指標 116
七、克弗爾發酵胜肽於營養缺乏型骨質疏鬆症AKR1A1缺失小鼠處理12週後，藉由微電腦斷層掃描分析儀評估延緩股骨骨小樑骨質流失之功效 126
(一)以微電腦斷層掃描分析儀重組股骨3D結構 126
(二)Micro-CT分析遠端股骨骨小樑參數 126
(三)Micro-CT分析遠端股骨皮質骨參數 126
八、克弗爾發酵胜肽於營養缺乏型骨質疏鬆症AKR1A1缺失小鼠處理12週後，藉由奈米壓痕分析儀評估股骨皮質骨生物力學 133
(一)硬度 133
(二)彈性係數 133
伍、討論 135
一、骨質疏鬆症動物模式比較 135
二、克弗爾對於AKR1A1基因缺失小鼠骨質疏鬆症動物模式生化指標分析 135
三、AKR1A1基因缺失小鼠骨質疏鬆症性別差異比較 136
四、克弗爾發酵胜肽對於AKR1A1基因缺失小鼠骨質疏鬆症動物模式影響 137
陸、結論 139
柒、參考文獻 142








圖目錄

圖 1、台灣男女全身平均骨密度與年齡關係。 7
圖 2、維生素C對於不同細胞分化影響。 12
圖 3、維生素D合成路徑。 13
圖 4、維生素K在骨骼中作用機制。 14
圖 5、維生素C合成路徑與突變圖譜。 17
圖 6、AKR1A1缺失小鼠股骨骨微結構變化。 18
圖 7、成骨細胞和骨形成的分子途徑示意圖。(VALENTI, DALLE CARBONARE AND MOTTES 2016) 22
圖 8、破骨細胞分化路徑。 28
圖 9、細胞激素對於骨代謝平衡機制。 29
圖 10、 IL-1對於不同細胞的功能 。 30
圖 11、骨骼中IL-6的細胞功能。 31
圖 12、TNF-Α 在破骨細胞的分化機制。 32
圖 13、電腦微斷層掃描分析儀運作圖。 34
圖 14、克弗爾發酵胜肽(KEFIR-FERMENTED PEPTIDES)對於營養缺失型骨質疏鬆症之AKR1A1基因缺失公鼠延緩骨質流失與改善骨微結構之功能性評估試驗流程圖。 41
圖 15、克弗爾發酵胜肽(KEFIR-FERMENTED PEPTIDES)對於營養缺失型骨質疏鬆症之AKR1A1基因缺失母鼠延緩骨質流失與改善骨微結構之功能性評估試驗流程圖。 42
圖 16、微電腦斷層掃描設定介面。 51
圖 17、奈米壓痕上機示意圖。 53
圖 18、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之活性氧自由基(ROS/RNS)影響分析。 63
圖 19、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO母鼠之活性氧自由基(ROS/RNS)影響分析。 65
圖 20、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 基因缺失小鼠性別之活性氧自由基(ROS/RNS)影響分析。 66
圖 21、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之硫巴比妥酸反應物(TBARS)影響分析。 67
圖 22、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之超氧歧化酶(SOD)影響分析。 68
圖 23、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之過氧化氫酶(CATALASE)影響分析。 69
圖 24、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之促炎性細胞激素影響分析。 70
圖 25、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之促炎性細胞激素影響分析。 71
圖 26、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之促炎性細胞激素影響分析。 72
圖 27、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之血清核因子Κ-B配體受體致活劑(RANKL)影響分析。 73
圖 28、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之血清護骨蛋白 (OPG)影響分析。 74
圖 29、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之血清核因子Κ-B配體受體致活劑與護骨蛋白比值(RANKL/OPG)影響分析。 75
圖 30、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之血清P1NP影響分析。 76
圖 31、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之骨組織P1NP影響分析。 77
圖 32、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之骨鈣素影響分析。 78
圖 33、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之骨組織骨鈣素影響分析。 79
圖 34、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之血清第一膠原蛋白碳端胜肽(CTX-1)影響分析。 80
圖 35、餵食克弗爾十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之骨組織第一膠原蛋白碳端胜肽(CTX-1)影響分析。 81
圖 36、餵食克弗爾十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO公鼠股骨股小樑骨微結構變化。 84
圖 37、餵食克弗爾十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO母鼠股骨股小樑骨微結構變化。 85
圖 38、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位骨小樑與組織所佔之比例。 86
圖 39、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位骨小樑數目。 87
圖 40、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位骨小樑間分離率。 88
圖 41、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位骨小樑厚薄度。 89
圖 42、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位骨小樑骨礦物質密度。 90
圖 43、餵食克弗爾十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO公鼠股骨皮質骨骨微結構變化。 93
圖 44、餵食克弗爾十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO母鼠股骨皮質骨骨微結構變化。 94
圖 45、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位皮質骨體積。 95
圖 46、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位皮質骨與組織所佔之比例。 96
圖 47、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位皮質骨表面積所佔之比例。 97
圖 48、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位皮質骨直徑。 98
圖 49、餵食克弗爾十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨骨垢部位皮質骨骨礦物質密度。 99
圖 50、餵食克弗爾十二週後誘導公鼠骨髓細胞分化成成骨細胞之活性影響。 102
圖 51、餵食克弗爾十二週後誘導母鼠骨髓細胞分化成成骨細胞之活性影響。 103
圖 52、餵食克弗爾十二週後誘導公鼠骨髓細胞分化成成骨細胞之礦化影響。 104
圖 53、餵食克弗爾十二週後誘導母鼠骨髓細胞分化成成骨細胞之礦化影響。 105
圖 54、餵食克弗爾十二週後誘導公鼠骨髓細胞分化成破骨細胞之活性影響。 106
圖 55、餵食克弗爾十二週後誘導母鼠骨髓細胞分化成破骨細胞之活性影響。 107
圖 56、定量成骨細胞ALP活化區域。 108
圖 57、定量成骨細胞礦化區域。 109
圖 58、定量破骨細胞活化區域。 110
圖 59、餵食克弗爾十二週後以奈米壓痕測試硬度。 112
圖 60、餵食克弗爾十二週後以奈米壓痕測試彈性係數。 113
圖 61、餵食克弗爾發酵胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之活性氧自由基(ROS/RNS)影響分析。 118
圖 62、餵食克弗爾發酵胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之硫巴比妥酸反應物(TBARS)影響分析。 119
圖 63、餵食克弗爾發酵胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之抗氧化酵素。 120
圖 64、餵食克弗爾胜肽十二週後對於AKR1A1 KO小鼠之促炎性細胞激素影響分析。 121
圖 65、餵食克弗爾胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之骨質代謝系統影響分析。 122
圖 66、餵食克弗爾胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之P1NP影響分析。 123
圖 67、餵食克弗爾胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之骨鈣素影響分析。 124
圖 68、餵食克弗爾胜肽十二週後對於AKR1A1 KO公鼠之第一膠原蛋白碳端胜肽(CTX-1)影響分析。 125
圖 69、餵食克弗爾胜肽十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO公鼠股骨股小樑骨微結構變化。 127
圖 70、餵食克弗爾胜肽十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨參數。 129
圖 71、餵食克弗爾胜肽十二週後以MICRO-CT合成俯視橫切3D圖，觀察AKR1A1 KO公鼠股骨皮質骨骨微結構變化。 130
圖 72、餵食克弗爾胜肽十二週後以微電腦斷層掃描軟體計算近膝關節的遠端股骨參數。 132
圖 73、餵食克弗爾胜肽十二週後使用奈米壓痕分析硬度及彈性係數。 134
圖 74、AKR1A1基因剔除小鼠骨質疏鬆症機制圖。 140
圖 75、克弗爾對於AKR1A1基因剔除小鼠預防骨質疏鬆症機制圖。 141




表目錄

表 1、台灣性別及年齡別平均骨密度 4
表 2、男性年齡體重身高與全身骨密度之回歸分析 5
表 3、女性年齡體重身高與全身骨密度之回歸分析 6
表 4、全球骨質疏鬆症男女患病率 7
表 5、台灣營養健康調查與美國國家健康營養檢查調查（NHANES 2005-2006）各年齡層與不同種族的股骨頸平均骨密度比較 8
表 6、維生素K對於骨質代謝的影響 14
表 7、維生素生合成路徑之基因剔除小鼠與大鼠的比較 19
表 8、常見骨質的血液與尿液生化指標 27
表 9、克弗爾發酵胜肽與已知的功能性胜肽100%相同序列的比對 36
表 10、分析參數設定 49
表 11、奈米壓痕測試設定參數 52
表 12、管餵克弗爾十二週對於AKR1A1基因缺失小鼠體重變化 56
表 13、管餵克弗爾十二週對於AKR1A1基因缺失小鼠攝食量變化 57

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