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研究生:黃凱昕
研究生(外文):Kai-Xin Huang
論文名稱:螺旋藻與小球藻抗發炎活性胜肽成分之篩選
論文名稱(外文):Screening of Anti-inflammatory Peptides from Spirulina platensis and Chlorella sorokiniana
指導教授:徐睿良徐睿良引用關係
指導教授(外文):Jue-Liang Hsu
口試委員:張誌益吳裕仁
口試委員(外文):Chi-I ChangYu-Jen Wu
口試日期:2017-07-11
學位類別:碩士
校院名稱:國立屏東科技大學
系所名稱:生物科技系所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2017
畢業學年度:105
語文別:中文
論文頁數:71
中文關鍵詞:螺旋藻小球藻活性胜肽抗發炎西方墨點法
外文關鍵詞:Spirulina platensisChlorella sorokinianaActive peptidesAnti-inflammatoryWestern blot
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螺旋藻 (Spirulina. platensis) 和小球藻 (Chlorella. sorokiniana) 均屬微藻,兩者皆含有各式豐富的營養成分,尤其是蛋白質的含量極高,每公斤蛋白質的含量約為雞蛋的四倍。藍藻與綠藻之蛋白質的保健功效已有一些文獻報導,例如在一些體外實驗顯示藍藻中的藍藻蛋白具有抗氧化、抗發炎、抗癌及肝保護等保健功效。然而,大多研究僅限於體外之細胞或酵素實驗,並未探討這些蛋白質經口服後受到腸胃道消化酵素的分解及分子太大不易被腸道吸收等問題。以保健食品的角度而言,以胜肽的形式比蛋白質更能為人體所吸收,也較具產業價值。本研究利用各式酵素對藍藻和綠藻蛋白進行水解,並利用活性指引分群 (Bioassay-guided fractionation) 的方式篩選具抗發炎功效之活性胜肽。結果顯示,藍藻和綠藻蛋白之嗜熱菌蛋白酶 (Thermolysin) 水解物同時,對於LPS誘發發炎反應之RAW細胞具有較佳的抑制Nitric oxide (NO) 生成之效果。而且隨著酵素水解物的濃度提高 (50 µg/µl ~ 400 µg/µl),發炎相關蛋白 iNOS及COX-2的表現量呈現劑量依賴性(Dose-Dependent)的減少。顯示此水解物具有初步抗發炎功效,具有開發成保健食品產品或是抗發炎藥物的潛力。
Spirulina platensis and Chlorella sorokiniana belong to microalgae, both of them contain abundant nutrients, especially protein. Their protein contents are about four times higher than that of hen egg . The health effects, such as antioxidant, anti-inflammatory, anti-cancer and liver protection, caused by Spirulina platensis (SP) and Chlorella sorokiniana (CS) proteins have been widely reported. However, those studies only focused on proteins’ activities demonstrated using in vitro models. They did not explore the compatibility and absorption of these proteins with gastrointestinal digestion enzyme after oral administration. In the point of view of health food, small peptide can be readily absorbed which allows more industrial applications. In this study, proteins from SP and CS were extracted and hydrolyzed by various enzymes. The peptides with anti-inflammatory efficacy were screened by means of bioassay-guided fractionation. The results showed that the thermolysin hydrolysate of SP andCS proteins had better effect on the inhibition of nitric oxide (NO) production in LPS-stimulated RAW cells. Meanwhile, the expression of iNOS and COX-2 were simultaneously decreased dose-dependently in the presence of thermolysin hydrolysate of SP and CS (50 µg/µl to 400 µg/µl). This result indicated that the hydrolysate from the both microalgae has a preliminary anti-inflammatory, effect, and they are potential for the development of health food products or as anti-inflammatory drugs.
目錄
中文摘要 I
Abstract III
致謝 V
圖目錄 IX
表目錄 XII
第一章 前言 1
第二章 文獻回顧 4
2.1藻類介紹 4
2.1.1螺旋藻 (藍藻) 4
2.1.2小球藻 (綠藻) 6
2.2發炎反應 (Inflammation) 8
2.3巨噬細胞 (Macrophages) 9
2.4一氧化氮 (Nitric oxide,NO) 9
2.5強陽離子交換層析 (Strong cation exchange chromatography,SCX ) 11
2.6 固相萃取 (Solid-Phase Extraction,SPE) 11
2.7超音波破碎 (Sonication) 12
2.8質量分析器 12
2.9串聯質譜分析 13
2.10資料庫應用 14
2.11 蛋白質體學 14
2.12研究動機 15
第三章 材料與方法 17
3.1實驗架構 17
3.2實驗材料 18
3.2.1實驗化合物 18
3.2.2藻類實驗材料製備 18
3.2.3實驗藥品以及試劑 19
3.2.4實驗儀器 20
3.3實驗方法 21
3.3.1巨噬細胞 21
3.3.2細胞存活率分析 23
3.3.3 LPS誘導巨噬細胞發炎反應 24
3.3.4 Nitric oxide ( NO ) 之測定 24
3.3.5蛋白質萃取 25
3.3.6蛋白質定量 25
3.3.7十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳 ( SDS-PAGE ) 26
3.3.8西方墨點法 ( Western blot ) 27
3.3.9 TCA ( Trichloroacetic acid) 蛋白質水解 28
3.3.10藻類水解物 29
3.3.11 強陽離子交換層析法 29
3.3.12 C18逆相管柱層析去鹽 30
3.3.13 Solid Phase Extraction (SPE) 分離 31
3.3.14 利用兩種不同酵素水解藻類 31
3.3.15 LC-MS/MS 串聯式質譜胜肽定性與定量分析 32
3.3.16 逆相高效能液相層析儀 (RP-HPLC) 分離 33
第四章 結果 34
4.1 藻類酵素水解物細胞存活率之分析 34
4.2藻類4種不同酵素水解物對LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide之影響 35
4.3藻類使用酵素(Thermolysin)水解物對LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide之影響 37
4.4藻類使用酵素(Thermolysin)水解物對LPS誘發後對iNOS蛋白質表現之影響 39
4.5藻類使用(Thermolysin)酵素水解物對LPS誘發後對COX-2蛋白質表現之影響 40
4.6螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物SPE fractionation有機溶劑分液細胞存活率之分析 41
4.7小球藻酵素(Thermolysin)水解物SPE fractionation有機溶劑分液細胞存活率之分析 42
4.8 螺旋藻酵素水解物之SPE fractionation利用LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide篩選活性胜肽 43
4.9 小球藻酵素水解物之SPE fractionation利用LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide篩選活性胜肽 44
4.10 藻類酵素水解物之RP-HPLC fractionation利用LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide篩選活性之胜肽 45
4.11 藻類酵素水解物之SCX fractionation利用LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide篩選活性胜肽 48
4.12藻類酵素水解物之SPE fractionation有機溶劑分液之胜肽鑑定 49
4.13螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,細胞存活率之分析 54
4.14小球藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,細胞存活率之分析 55
4.15 螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,對LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide之影響 56
4.16 小球藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,對LPS誘導活化巨噬細胞分泌Nitric oxide之影響 57
4.17螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,與小球藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,對LPS誘發後對iNOS蛋白質表現之影響 58
4.18螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,與與小球藻酵素(Thermolysin)水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,對LPS誘發後對COX-2蛋白質表現之影響 59
4.19利用質譜製備IW-5和IV-5檢量線與定量 61
第五章 討論 63
第六章 結論 65
第七章 參考文獻 67
作者簡介 71

圖目錄
圖 1、螺旋藻 (藍藻) 5
圖 2、小球藻 (綠藻) 7
圖 3、活性胜肽之篩選、鑑定與細胞評估之流程圖。 17
圖 4、螺旋藻使用不同濃度酵素 (Thermolysin) 水解物處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 34
圖 5、小球藻使用不同濃度酵素(Thermolysin)水解物處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 35
圖 6、螺旋藻使用4種不同酵素水解物,以相同濃度400 ppm對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 36
圖 7、小球藻使用4種不同酵素水解物,以相同濃度400 ppm對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 37
圖 8、螺旋藻使用酵素(Thermolysin)水解物不同濃度處理12小時後,對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 38
圖 9、小球藻使用酵素(Thermolysin)水解物不同濃度對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 38
圖 10、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物於不同濃度情況下之iNOS蛋白表現量。 39
圖 11、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物於不同濃度情況下之iNOS蛋白表現量。 40
圖 12、螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物於不同濃度情況下之COX-2蛋白表現量。 41
圖 13、小球藻酵素(Thermolysin)水解物於不同濃度情況下之COX-2蛋白表現量。 41
圖 14、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE fractionation有機溶劑分液處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 42
圖 15、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE fractionation有機溶劑分液處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 43
圖 16、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物利用SPE收集不同有機溶劑分液後,進行活性分液之篩選。 44
圖 17、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物利用SPE收集不同有機溶劑分液後,進行活性分液之篩選。 45
圖 18、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物RP-HPLC分群層析圖圖。 46
圖 19、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物 RP-HPLC 分群層析圖。 46
圖 20、螺旋藻酵素(Thermolysin)水解物透過HPLC分群之分液處理12小時後,對LPS誘導RAW264.7 Macrophage 發炎後,NO生成之效果。 47
圖 21、小球藻使用Thermolysin水解之水解物進行 HPLC 分群之分液處理12小時後,對LPS誘導RAW264.7 Macrophage 發炎後,NO生成之效果。 47
圖 22、螺旋藻使用Thermolysin水解之水解物進行 SCX 分群之分液,對LPS誘導RAW264.7 Macrophage 發炎後,NO生成之效果。 48
圖 23、小球藻使用Thermolysin水解之水解物進行 SCX 分群之分液,對LPS誘導RAW264.7 Macrophage 發炎後,NO生成之效果。 49
圖 24、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 20 %有機溶劑分液鑑定之胜肽IWDPQ。 50
圖 25、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 20 %有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW。 51
圖 26、胜肽片段IGGPW之MS/MS圖。 51
圖 27、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 40 %有機溶劑分液鑑定之胜肽AMPPYPY。 52
圖 28、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 40 %有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV。 52
圖 29、胜肽片段IFGPV之MS/MS圖。 52
圖 30、胜肽片段IGGPW使用不同濃度處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 55
圖 31、胜肽片段IFGPV使用不同濃度處理12小時後,對RAW264.7巨噬細胞存活率之分析。 56
圖 32、胜肽片段IGGPW使用不同濃度處理12小時後,對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 57
圖 33、胜肽片段IFGPV使用不同濃度處理12小時後,對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞發炎後,NO生成之效果。 58
圖 34、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,於不同濃度情況下之iNOS蛋白表現量。 59
圖 35、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,於不同濃度情況下之iNOS蛋白表現量。 59
圖 36、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IGGPW,於不同濃度情況下之COX-2蛋白表現量。 60
圖 37、小球藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽IFGPV,於不同濃度情況下之COX-2蛋白表現量。 60
圖 38、胜肽IGGPW 多重反應監控之分析。 61
圖 39、胜肽IGGPW 之檢量線。 61
圖 40、胜肽IFGPV 多重反應監控之分析。 62
圖 41、胜肽IFGPV 之檢量線。 62

表目錄
表 1、Reversed-phase High Performance Liquid Chromatography分離水解物沖提條件 33
表 2、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 20% 有機溶劑分液鑑定之胜肽 53
表 3、螺旋藻酵素 (Thermolysin) 水解物SPE 40% 有機溶劑分液鑑定之胜肽 54
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