臺灣博碩士論文加值系統

到目前為止，透過基因表現圖譜去區分惡性腫瘤具臨床意義相關的亞型，仍侷限在一部分的癌症類型中，我們假設使微陣列數據資料作為癌症分型不良的一個可能原因是臨床癌症樣本的細胞構成狀況，不像體外實驗研究可以單一種細胞株進行實驗，臨床的癌症樣本為異質混合的樣本，包含的不只有癌細胞，還有大量的周遭間質細胞、免疫細胞。像這樣混合其他細胞的樣本，其基因表現圖譜反應的不只有癌細胞的訊號，也包含其他來自癌症腫瘤微環境中其他細胞的訊號。
肝細胞癌（肝癌）是臺灣盛行率排名第三名的癌症，目前的治療方案和預後推測很大程度是來自於發病年齡和組織學上的分期。
在本研究中，我們應用non-negative matrix factorization (NMF)分析50個肝癌臨床樣本的基因表現特徵，分解出之中的免疫細胞特徵，為了使NMF更容易的從微陣列資料做分解，我們還從NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)收集數種免疫細胞一起進行分析，我們用NMF分解基因 X 樣本的基因表現量的矩陣(V)，成兩個子矩陣，基因 X metagene 的W矩陣，和 metagene X樣本的H矩陣。W矩陣的metagene可以看作是從樣本拆解出來的子基因表現模式，H矩陣的 metagene則可以作為樣本這些基因表現模式組成的權重，某一些metagene可以當作是免疫細胞的特徵，而有一些可能只是雜訊。我們發現這些metagene的強度在不同病人中的差異對於存活有所關聯，並且這個發現一定程度上符合目前已知免疫細胞與預後的相關性。

So far clinically relevant subtyping of malignancy by using gene expression profiles has been restricted to only a few cancer types. We hypothesized that a plausible factor hampering the use of microarray data for subtyping cancers might be the cellularity of clinical cancer samples. Opposing to in vitro studies can using a single cell line, clinical cancer samples from patients could be heterogeneous and contain not only cancer cells but also a variety of stromal cells as well as immune cells. Gene expression profiles of such complex clinical samples might reflect not only the expression signature of cancer cells, but also signals from a combination of many cells in the cancer microenvironment.
Hepatocellular carcinoma (HCC) is the third most common cancer in Taiwan. The regimen and prognosis estimation of HCC is largely dependent on the age of onset and histology-based staging.
In this study, we applied non-negative matrix factorization (NMF) to analyze the gene expression signatures of ~50 clinical samples of HCCs. To facilitate the factorization, microarray data sets of various types of immune cells, were retrieved from NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). We used NMF to factorize a matrix(V) of G genes X S samples into two sub-matrices, matrix W of G gene weights X K factors, and matrix H of K factor X S sample weights. Each factor in W could be viewed as a sub-signature of the expression profile shared by multiple samples including cancers and immune cells, whereas H provides the weight for each K factor in each sample. We noticed that some factors are likely to represent the unique features of immune cells, while others might reflect background noises. The differential strengths of certain sub-signatures in different cancer samples showed significant correlation with patients’ survival. These findings are to a certain extent consistent with our current knowledge about the relevance of immunity in cancer prognosis.

中文摘要 i
ABSTRACT ii
誌謝 iv
目錄 v
圖目錄 x
表格目錄 xiii
第1章 背景介紹 1
1.1 癌症現況 1
1.2 癌症的分子診斷與治療 1
1.3 肝癌的介紹 2
1.4 腫瘤的微環境 2
1.5 微陣列(microarray) 4
1.6 研究目標 4
第2章 材料與方法 5
2.1 Overview 5
2.2 Hepatocellular carcinoma microarray data 5
2.3 Immune cell microarray data 7
2.4 Non-negative matrix factorization(NMF) 9
2.4.1 NMF的介紹 9
2.4.2 NMF的計算方式 10
2.4.3 決定NMF使用的rank 12
2.5 流程 14
2.6 存活分析 16
第3章 使用NMF 分析肝癌及單一種細胞株之微陣列數據 17
3.1 使用3片M2巨噬細胞株樣本的結果 19
3.1.1 使用完整的MAS5的NMF結果 20
3.1.2 使用MAS5，但不進行scale normalization 22
3.1.3 使用完整的RMA的NMF結果 22
3.1.4 使用RMA，但不用log轉換 24
3.1.5 使用 RMA，但不進行quantile normalization 25
3.1.6 使用RMA，但不進行log轉換及quantile normalization 25
3.2 使用9片M2巨噬細胞株樣本的結果 26
3.2.1 使用完整的MAS5的NMF結果 27
3.2.2 使用MAS5，但不進行scale normalization 29
3.2.3 使用完整的RMA的NMF結果 29
3.2.4 使用RMA，但不用log轉換 33
3.2.5 使用 RMA，但不進行quantile normalization 34
3.2.6 使用RMA，但不進行log轉換及quantile normalization 34
3.3 使用T helper 2 細胞株樣本的結果 37
3.3.1 使用完整的MAS5的NMF結果 38
3.3.2 使用MAS5，但不進行scale normalization 40
3.3.3 使用完整的RMA的NMF結果 40
3.3.4 使用RMA，但不用log轉換 42
3.3.5 使用 RMA，但不進行quantile normalization 42
3.3.6 使用RMA，但不進行log轉換及quantile normalization 42
3.4 以RMA進行微陣列數據之 normalization 的結果，較適合用來進行 NMF 43
第4章 使用NMF 分析肝癌及多種種細胞株之微陣列數據 44
4.1 M1 Macrophage 和 M2 Macrophage與腫瘤樣本的結果 45
4.1.1 M1 marcophage 和M2 marcophage的樣本挑選 45
4.1.2 以M1 marcophage 和M2 marcophage 與腫瘤樣本進行NMF的結果 46
4.1.3 M1 marcophage 和M2 marcophage相關metagene與肝癌病人預後的分析 53
4.1.4 結論 55
4.2 T helper cell 1 和T helper cell 2與腫瘤樣本的結果 56
4.2.1 T helper 1和T helper 2的樣本選擇 56
4.2.2 以T helper 1 和T helper 2 與腫瘤樣本進行NMF的結果 57
4.2.3 Th1和Th2相關metagene與肝癌病人預後的分析 62
4.2.4 結論 63
4.3 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF結果 64
4.3.1 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的樣本選擇 64
4.3.2 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF結果 67
4.3.3 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與預後的分析 73
4.3.4 結論 74
4.4 Regulatory T cells的結果 75
4.4.1 Regulatory T cells的樣本選擇 75
4.4.2 Regulatory T cells的NMF結果 77
4.4.3 Regulatory T cells與預後的分析 79
4.4.4 Regulatory T cells與腫瘤樣本分析結果的結論 80
4.5 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌、老年型肝癌的結果 81
4.5.1 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞選擇的樣本 82
4.5.2 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌的NMF結果 83
4.5.3 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌與預後的分析 90
4.5.4 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌的NMF結果 91
4.5.5 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌的存活分析 97
4.5.6 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌與老年型肝癌之分析結論 99
第5章 結論及未來展望 100
5.1 總結 100
5.2 研究方法之討論 101
5.3 未來展望 102
References 103


圖目錄
圖 1 NMF應用在分解基因表現量矩陣的示意圖 11
圖 2決定rank的cophenetic和dispersion範例 13
圖 3本研究的主要流程 14
圖 4 對NMF進行測試與分析的流程 15
圖 5 使用完整的MAS5的NMF之結果H矩陣的heatmap 21
圖 6 使用完整的RMA的NMF結果之H矩陣的heatmap 23
圖 7 使用3片M2巨噬細胞，並使用完整的RMA的NMF結果的H矩陣之metagene 2的直條圖 24
圖 8 使用9片M2 macrophage樣本，並使用MAS5的NMF結果之H矩陣的heatmap 28
圖 9 使用9片M2 macrophage樣本，並使用RMA的NMF結果之H矩陣的heatmap 30
圖 10 使用9片M2巨噬細胞，並使用完整的RMA的NMF結果之metagene 8之直條圖 31
圖 11 使用9片M2巨噬細胞，並使用完整的RMA的NMF結果之metagene 12之直條圖 31
圖 12 使用 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果，癌症病患依metagene 12數值高低區分為兩組的存活曲線 33
圖 13 使用9片M2 macrophage樣本，並使用RMA，但不進行log轉換及quantile normalization的NMF結果之H矩陣的heatmap 36
圖 14 使用3片Th2樣本並使用完整的MAS5的NMF結果之H矩陣heatmap 39
圖 15 使用3片Th2 樣本並使用完整RMA的NMF結果之H矩陣heatmap 41
圖 16 M1巨噬細胞 和M2巨噬細胞與腫瘤樣本進行NMF結果之W矩陣的heatmap 48
圖 17 M1 巨噬細胞和M2巨噬細胞與腫瘤樣本進行NMF結果之H矩陣的heatmap 49
圖 18 M1 巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 11 數值分佈圖 50
圖 19 M1 巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 14 數值分佈圖 51
圖 20 M1巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果，癌症病患依metagene 11高低區分為兩組的存活曲線 54
圖 21 M1 巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果，癌症病患依metagene 14高低區分為兩組的存活曲線 54
圖 22 T helper cell 1 和T helper cell 2與腫瘤樣本NMF結果之H矩陣的heatmap 58
圖 23 Th1與 Th2與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 6 數值分佈圖 59
圖 24 Th1與 Th2與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 14 數值分佈圖 60
圖 25 Th1與 Th2與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 15 數值分佈圖 60
圖 26 依Th1特徵高低分組的癌症病患存活曲線 62
圖 27 依Th2特徵高低分組的癌症病患存活曲線 63
圖 28 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與腫瘤樣本的NMF結果之H矩陣的heatmap 68
圖 29 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與腫瘤進行NMF後透過H矩陣做樣本分群的兩群之存活曲線 73
圖 30 Treg與腫瘤樣本NMF結果之H矩陣的heatmap 77
圖 31 Treg與腫瘤樣本NMF結果之H矩陣的metagene 9的數值分佈 78
圖 32 Treg與腫瘤進行NMF後透過H矩陣做樣本分群的兩群之存活曲線 79
圖 33 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型腫瘤樣本的NMF結果之H矩陣的heatmap 84
圖 34 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型腫瘤樣本的NMF結果之H矩陣的heatmap 92
圖 35受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型腫瘤樣本進行NMF，依metagene 7數值高低50%分組之兩組的存活曲線 98


表格目錄
表格 1本研究使用的免疫細胞樣本資料 8
表格 2 兩種常見標準化的方法 15
表格 3使用單一種細胞株的測試一覽 18
表格 4 使用3片 M2 macrophage樣本的結果整理 19
表格 5 使用9片M2 macrophage樣本的結果整理 26
表格 6 使用9片M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 12之IPA部分結果 32
表格 7使用3片 T helper cell樣本的NMF結果整理 37
表格 8 多種類免疫細胞與腫瘤樣本進行NMF分析的列表 44
表格 9 4.1 所使用的免疫細胞微陣列樣本列表 46
表格 10 M1 巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 11之部分IPA結果 52
表格 11 M1 巨噬細胞與 M2巨噬細胞與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 14之部分IPA結果 52
表格 12 4.2 所使用的免疫細胞樣本列表 57
表格 13 Th1與Th2與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 14之IPA部分結果 61
表格 14 Th1與Th2與腫瘤組織樣本的NMF結果之H矩陣的metagene 15之IPA部分結果 61
表格 15 4.3 所使用的細胞樣本列表 65
表格 16 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF之metagene 2的部分IPA結果 69
表格 17 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF之metagene 17的部分IPA結果 70
表格 18 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF之metagene 6的部分IPA結果 71
表格 19 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞的NMF之metagene 18的部分IPA結果 72
表格 20 Treg所使用的免疫細胞微陣列表 76
表格 21 Treg與腫瘤樣本NMF結果之metagene 9的IPA分析結果 79
表格 22 4.5 所使用的免疫細胞樣本 82
表格 23 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 3的部分IPA結果 85
表格 24 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 4的部分IPA結果 85
表格 25 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 5的部分IPA結果 86
表格 26 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 7的IPA結果 86
表格 27 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 8的部分IPA結果 87
表格 28 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 9的部分IPA結果 87
表格 29 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 10的部分IPA結果 88
表格 30 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型腫瘤樣本的NMF之metagene整理 89
表格 31 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與年輕型腫瘤樣本進行NMF，病患依metagene 高低區分為兩組後之log rank test結果 90
表格 32 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 4的部分IPA結果 93
表格 33 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 7的部分IPA結果 94
表格 34 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 9的部分IPA結果 95
表格 35 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 10的部分IPA結果 95
表格 36 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene 11的部分IPA結果 96
表格 37 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF之metagene整理 96
表格 38 受抑制的T細胞+M2巨噬細胞+自然殺手細胞與老年型肝癌腫瘤樣本的NMF，病患依metagene 高低區分為兩組後之log rank test結果 97

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