臺灣博碩士論文加值系統

近年來，在癌症治療上，免疫治療逐漸受到重視，2014年唐獎的生技醫藥獎就頒發給研究免疫治療的團隊，其團隊發現在免疫細胞表面的PD-1蛋白質會與癌細胞表面的PD-L1蛋白質作用，使得T細胞的活性受到抑制，導致免疫細胞不會對癌細胞進行攻擊。
本研究主要目的為協助實驗團隊篩選用來阻擋PD-1/PD-L1結合的小分子藥物。從Protein Data Bank搜尋出可以使用的PD-1蛋白質結構，利用VMD tool對結構進行superimpose、比對3D空間中amino acids的結構位置變化，再利用PCoA的方法進行分組，以取得更多可以用來進行docking的PD-1蛋白質結構。從DrugBank搜尋具有3D結構的小分子藥物，利用MGLTools將小分子藥物轉檔成PDBQT的格式，透過AutoDock Vina進行docking，找出會與PD-1蛋白質結合的小分子藥物，再利用HBPLUS計算小分子藥物跟蛋白質之間的氫鍵作用力，篩選出會和PD-1蛋白質結合的小分子藥物。
從NCBI GEO找出兩組T細胞被活化及被抑制的microarray data，經過RMA分析，將分析結果放進Connectivity map查詢，利用Cmap的結果進行二次篩選，篩選docking所得到的小分子藥物，找出會和PD-1蛋白質結合，並且不會導致T細胞被抑制的小分子藥物。最後透過兩種篩選方式，找出32種小分子藥物使用後，不會抑制T細胞，11種小分子藥物使用後，會活化T細胞，最後可以得到9種小分子藥物有潛力成為治療癌症的小分子藥物。

The programmed death 1 (PD-1) and programmed death-ligand 1 (PD-L1) pathway is a promising therapeutic target for cancers. Clinical studies suggest that administration of anti-PD-1 protein drugs to treat certain cancers substantially improves the survival of patients. The specific aim of this study is to perform an in silico screening for small-molecular chemicals form DrugBank that can bind to PD-1 without initiating the downstream activation of PD-1 signaling pathways.
To collect PD-1 protein structures for computational molecule docking, X-ray diffraction structures of PD-1 were used as the reference structures, and the NMR structures were clustered into two groups (i.e. free form and complex form). Then the structures of DrugBank small-molecule drugs were docked with these PD-1 structures by using AutoDock Vina. HBPLUS was used to infer the interactions and the hydrogen bonds formed between candidate drugs and PD-1, in particular the regions that are important for the interaction with PD-L1. Only drugs that can bind with high affinity to both the inactivated and activated forms of PD-1 would be kept.
To further filter the candidate drugs, we took advantage of Connectivity map (Cmap). Taking the gene expression signature of T cells inferred from the microarray data sets retrieved from NCBI Gene Expression Omnibus database (GEO), the candidate drugs that might lead to the reversion of the signature of activated T cells in Cmap were labeled and assigned with lower priorities. Finally, nine candidate drugs that are likely to bind PD-1 remained and they might not inactivate T cell functions.

目錄
誌謝 i
中文摘要 ii
Abstract iii
目錄 v
圖目錄 vii
表目錄 ix
第一章 背景介紹 1
1.1. 癌症治療的新趨勢之一是免疫調節療法 1
1.1.1 癌細胞可以表現PD-L1，逃避免疫細胞的攻擊 1
1.1.2 現有的癌症療法有哪些 1
1.1.3 免疫療法逐漸受到注意 3
1.2. PD-1, PD-L1的介紹及功用 4
1.2.1 PD-1, PD-L1的功能是怎麼被發現的 4
1.3. 癌組織微環境的定義 5
1.4. PD-1, PD-L1在生物學上的意義 5
1.5. 何謂Drug repurposing 6
1.6. Drug repurposing優點 7
1.7. 過去怎麼做Drug repurposing 8
1.8. 蛋白質藥物、小分子藥物的定義及介紹 8
1.8.1 蛋白質藥物 8
1.8.2 小分子藥物 9
第二章 材料與方法 10
2.1. 材料 – 取得PD1之蛋白質結構 10
2.1.1 查詢 PDB 取得PD-1蛋白質結構 11
2.1.1.1 X-ray crystallography 12
2.1.1.2核磁共振 (Nuclear magnetic resonance ; NMR) 12
2.1.2 利用DrugBank取得小分子藥物3D結構 12
2.2 材料 - Microarray data 16
2.3. 方法 18
2.3.1方法一 – 利用docking篩選小分子藥物 20
2.3.1.1 Docking簡介 20
2.3.1.2 現有的Docking工具 20
2.3.1.3 利用AutoDock Vina進行docking 20
2.3.2 方法二 - 利用藥物與基因表現之關聯性進行二次篩選 26
2.3.2.1 Connectivity map簡介 27
2.3.2.2 利用 Cmap 進行二次篩選阻斷PD-1 – PDL1 結合之小分子藥物的策略 29
第三章 PD-1蛋白質結構的篩選以及利用docking的方法，篩選可以和PD-1結合的小分子藥物 31
3.1. 利用PCoA篩選PD-1蛋白質結構 31
3.2. Docking後，可以和PD-1結合之小分子藥物 45
第四章 利用Cmap對和PD-1可結合之小分子藥物，進行二次篩選 53
4.1 Microarray data分析流程及DAVID分析 53
4.2. Microarray data分組 59
4.2.1 利用GSE30678、GSE39594兩組data去掉會抑制T細胞的小分子藥物 61
4.2.2 利用GSE30678、GSE39594兩組data找出會活化T細胞的小分子藥物 64
4.2.3 利用GSE30678 data去掉會抑制T細胞的小分子藥物 66
4.2.4 利用GSE30678 data找出會活化T細胞的小分子藥物 68
4.2.5 利用GSE39594 data去掉會抑制T細胞的小分子藥物 70
4.2.6 利用GSE39594 data找出會活化T細胞的小分子藥物 73
4.2.7 統整經過Cmap二次篩選之小分子藥物的結果 75
第五章 討論及未來展望 79
5.1. Summary 79
5.2. Future work - LINCS 84
References 86
附錄 88


圖目錄
Figure 1. 藥物開發過程及時間 7
Figure 2. 2D sdf 檔案格式 14
Figure 3. 3D sdf 檔案格式 14
Figure 4. 小分子藥物轉檔流程 16
Figure 5. 主要方法的流程圖 19
Figure 6. AutoDock Vina Plugin模擬圖，所有的PD-1蛋白質結構經過superimpose後，都可以在docking的區域內 21
Figure 7. Docking的記錄檔，會將output的pdb檔的9個model的affinity列表記錄在裡面 22
Figure 8. AutoDock Vina的結果檔後處理流程 23
Figure 9. 使用LigPlus畫出小分子藥物與蛋白質上的amino acids氫鍵及凡德瓦力示意圖 24
Figure 10. hb2檔案格式 25
Figure 11. 利用PyMOL呈現PD-1/PD-L1產生交互作用之amino acids 26
Figure 12. PD-1/PD-L1結合示意圖 28
Figure 13. 利用Cmap進行二次篩選小分子藥物的策略 30
Figure 14. PD-1蛋白質3D結構的比較；左圖為一般狀態與抗體結合的比較，右圖為一般狀態與PD-1/PD-L1結合態之比較，引用自 [18] 32
Figure 15. PD-1蛋白質上的氨基酸與抗體及PD-L1會產生交互作用的氨基酸；藍色線代表蛋白質與蛋白質之間氫鍵的直接作用力，綠線代表以水為媒介產生的氫鍵作用力，紅線為鹽橋，引用自 [18] 33
Figure 16. 比較各個PD-1蛋白質結構，只留下可以用的PD-1蛋白質結構 34
Figure 17. 使用VMD的流程 35
Figure 18. 此圖是用所有重要amino acids在空間中的位置倆倆相比之後，產生的RMSD列表，所畫出的PCoA圖 38
Figure 19.A. C loop包含的amino acids號碼：66、68 40
Figure 20.A. 可以與結合態（4ZQK）結構相似之PD-1結合之藥物范式圖 46
Figure 21. 可以與PD-1結合的小分子藥物之親和力常態分佈圖 48
Figure 22. 可以與PD-1結合的小分子藥物之氫鍵數常態分布圖 49
Figure 23. 可以與PD-1結合的90種小分子藥物之親和力常態分布圖 51
Figure 24. 可以與PD-1結合的90種小分子藥物之氫鍵數常態分布圖 52
Figure 25. microarray data RMA分析流程 53
Figure 26. QC Stats，以GSE30678為例 54
Figure 27. MDS plot (after RMA normalization)，以GSE30678為例 56
Figure 28. Boxplot (after RMA normalization) ，以GSE30678為例 56
Figure 29. Spike-in control probes_heatmap (after RMA normalization) ，以GSE30678為例 57
Figure 30. GSE30678挑選的genes放進DAVID查詢的結果 58
Figure 31. GSE39594挑選的genes放進DAVID查詢的結果 59
Figure 32. 去掉可能會抑制T細胞之小分子藥物後的小分子藥物范氏圖 63
Figure 33. 找出會活化T細胞之小分子藥物的小分子藥物范氏圖 65
Figure 34. 利用GSE30678的data去掉可能會抑制T細胞之小分子藥物後的小分子藥物范氏圖 67
Figure 35. 利用GSE30678的data找出會活化T細胞之小分子藥物的小分子藥物范氏圖 69
Figure 36. 利用GSE39594的data去掉可能會抑制T細胞之小分子藥物的小分子藥物范氏圖 72
Figure 37. 利用GSE39594的data找出會活化T細胞之小分子藥物的小分子藥物范氏圖 74
Figure 38. Cmap查詢小分子藥物之結果（節錄） 79
Figure 39. 被篩選出來的9種小分子藥物與其他不被作為候選藥物的親和力比較 81
Figure 40. 被篩選出來的9種小分子藥物與其他不被作為候選藥物的氫鍵數比較 81
Figure 41. 9種小分子藥物之親和力長條圖 82
Figure 42. 9種小分子藥物之氫鍵數長條圖 82


表目錄
Table 1. PDB 所提供的人類的PD-1蛋白質結構 11
Table 2. 本研究所使用之microarray data 17
Table 3. microarray data分組 18
Table 4. 4個loops的PCoA結果整理 39
Table 5. 90種藥物列表 50
Table 6. microarray分組對照表 55
Table 7. microarray data sets的分組 60
Table 8. 去掉可能會抑制T細胞之小分子藥物後，剩下的32種小分子藥物 62
Table 9. 找出會活化T細胞的小分子藥物列表，共11種 65
Table 10. 利用GSE30678的data去掉可能會抑制T細胞的小分子藥物後，剩下來的23種藥物 67
Table 11. 利用GSE30678的data找出會活化T細胞的小分子藥物列表，共13種 68
Table 12. 利用GSE39594的data去掉可能會抑制T細胞之小分子藥物列表，剩下55種小分子藥物 71
Table 13. 利用GSE39594的data找出會活化T細胞之小分子藥物列表，共21種 74
Table 14. 90種小分子藥物再經過Cmap篩選後，得到分數為4的小分子藥物 76
Table 15. 90種小分子藥物再經過Cmap篩選後，得到分數為3的小分子藥物 76
Table 16. 90種小分子藥物再經過Cmap篩選後，得到分數為2的小分子藥物 77
Table 17. 90種小分子藥物再經過Cmap篩選後，得到分數為1的小分子藥物 78
Table 18. 90種小分子藥物再經過Cmap篩選後，得到分數為0的小分子藥物 78

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