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研究生:丘硯蕙
研究生(外文):Yan-Hui Chiu
論文名稱:GTPase 相關基因 ect2 和 wasf1 對斑馬魚胚胎血管發育的影響
論文名稱(外文):The effects of GTPase related gene ect2 and wasf1 on vascular development in zebrafish
指導教授:吳長益
指導教授(外文):Chang-Yi Wu
學位類別:碩士
校院名稱:國立中山大學
系所名稱:生物科學系研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2019
畢業學年度:107
語文別:中文
論文頁數:71
中文關鍵詞:VEGF路徑尾部靜脈叢區間血管BMP路徑wasf1ect2斑馬魚血管新生
外文關鍵詞:BMP pathwayISVwasf1CVPVEGF pathwayect2zebrafishangiogenesis
相關次數:
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血管發育在脊椎動物中很重要,並受複雜信號通路所調控。在形成血管的過程中主要分為脈管生成和血管新生。對於研究脊椎動物的血管發育來說斑馬魚是種有利且方便的模式生物。GTPase相關基因在先前研究中被證實在血管新生和細胞的分化遷移增生等血管發育的過程中是不可或缺的角色,實驗室也從中篩選一些GTPase相關基因作為研究,透過原位組織染色發現一些表現在血管相關位置的基因,而進一步選ect2和wasf1作為研究主題。先前實驗室研究確定了血管上游轉錄因子nr2f1b / islet2對於區間血管(ISV)和尾部靜脈叢(CVP)的生長是不可或缺的,本文中也透過分析mRNA來確認ect2/wasf1是否會受到nr2f1b / islet2的影響。在這本研究中,我們選擇兩種GTPase相關基因wasf1和ect2作為研究,來瞭解它們對血管發育的重要性。比對ect2和wasf1的胺基酸序列,發現功能域在脊椎動物間有高度的保守性。原位組織染色顯示ect2和wasf1 mRNA在發育中頭部、初級血管、軀幹及尾部中會有高度的表現。透過morpholino顯微注射來降低ect2和wasf1導致血管缺陷以及心包膜腫大的問題。先前實驗室透過AO染色及TURNEL檢測已得知這些缺陷並不是由細胞凋亡所產生的。使用confocal較大倍率觀察絲狀偽足的生長發現數目大幅降低,以及在血管中的細胞數明顯的減少,說明knockdown ect2和wasf1會對細胞增生及遷移產生影響。而與血管性缺陷一致,ect2或wasf1的減少降低了血管marker的表現量。
Vascular development is an important process in vertebrate embryonic development, which is known to be regulated by complex signaling pathways. In the process of vascular formation are mainly divided into vasculogenesis and angiogenesis. GTPase related genes has been shown the importance in angiogenesis, cell migration, and proliferation etc. In the previous study, we have found some GTPase related genes which would express in developing vessels. Using zebrafish, a powerful vertebrate model organism to study vascular development, we have identified the transcription factors nr2f1b/islet2 is required for blood vessel formation. We mainly focused on the patterning of intersegmental vessels (ISV) and caudal vein plexus (CVP). Using mRNA analyzes, we have confirmed that ect2/wasf1 is regulated by nr2f1b / islet2. Hence, we are interested in how those GTPase related genes contribute to vascular patterning in zebrafish. In this study, we investigated the significance of two novel GTPase related genes, wasf1 and ect2, in vascular development. In-situ hybridization showed that both ect2 and wasf1 mRNA expressed in developing vessels. Knockdown of ect2 and wasf1 by morpholino microinjection caused defect in blood vessel formation. Our previous study suggested that vascular defects were not caused by cell death, but more likely resulted from the impairment of cell proliferation and migration. Consistent with our finding, loss of ect2 or wasf1 reduced the expression of the vascular markers.
論文審定書 i
中文摘要 ii
Abstract iii
目錄 iv
圖次 vi
表次 vii
縮寫 viii
壹、前言 1
一、 模式生物-斑馬魚 1
二、 斑馬魚的血管發育 1
三、 VEGF-NOTCH訊息調控傳遞路徑 2
四、 BMP訊息調控傳遞路徑 2
五、 GTPase 3
六、 ect2 3
七、 wasf1 4
貳、實驗材料與方法 5
一、 斑馬魚飼養 5
三、 顯微注射 (Microinjection) 5
四、 RNA萃取及cDNA製作 6
五、 建構質體 7
六、 DIG labeling RNA探針製作 7
七、 原位組織染色 7
八、 蛋白質萃取 8
九、 西方墨點法 (western blot) 9
十、 Quantitative real time polymerase chain reaction PCR (q-PCR) 10
十一、 DNA 電泳 10
十二、 DNA 純化 11
十三、 免疫螢光染色 (Immunostaining) 11
十四、 影像拍攝 11
十五、 統計分析 12
參、實驗結果 13
一、 實驗假說及研究動機 13
1. 實驗假說 13
2. ect2和wasf1與血管上游轉錄因子之關係 13
二、 ect2 和 wasf1 的序列分析與基因表現 13
1. ect2 和 wasf1 在脊椎動物中具有高度的保守性 13
2. ect2 mRNA 和 wasf1 mRNA 於斑馬魚胚胎發育時的表現位置 14
三、 ect2對斑馬魚血管發之影響 14
1. Knockdown ect2 造成斑馬魚胚胎血管發育之影響 14
2. Knockdown ect2 造成斑馬魚胚胎心包膜腫大及血管功能缺陷 15
3. Knockdown ect2 造成細胞遷移受到抑制 16
4. Knockdown ect2 對細胞增生的影響 16
5. Knockdown ect2 對於動靜脈基因表現量的影響調控 17
6. Knockdown ect2 對其他器官組織的影響 17
四、 wasf1 對斑馬魚血管發之影響 18
1. Knockdown wasf1 造成斑馬魚胚胎血管發育的影響 18
2. Knockdown wasf1 造成斑馬魚胚胎心包膜腫大及血管功能缺陷 18
3. Knockdown wasf1 造成細胞遷移受到抑制 19
4. Knockdown wasf1 對細胞增生的影響 19
五、 ect2 和 wasf1間的關係 20
肆、問題討論 21
一、 過度表現ect2或wasf1是否會造成血管過度生長 21
二、 ect2和wasf1間的交互關係 21
三、 ect2和wasf1對於纖維狀肌動蛋白的影響 21
四、 wasf1在斑馬魚胚胎中對細胞遷移的影響 22
伍、圖 23
陸、表 42
柒、參考文獻 44
陸、附錄 49
附件一、脈管生成 (vasculogenesis) 及血管新生 (angiogenesis) 49
附件二、血管新生(angiogenic) 50
附件三、注射ect2e3i3 MO 會使mRNA造成錯誤剪接 51
附件四、Knockdown ect2 並未增加血管內皮細胞的凋亡 52
附件五、Knockdown ect2 造成斑馬魚胚胎頭部積血 53
附件六、Knockdown wasf1 影響動靜脈 marker 表現量 54
附件七、knockdown wasf1 對於斑馬魚胚胎組織器官發育的影響 56
附件八、Knockdown wasf1 並未增加血管內皮細胞的凋亡 57
附件九、藥品配製 58
QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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