臺灣博碩士論文加值系統

活性氧化物質 (Reactive oxygen species，ROS)，是生物有氧代謝過程中的一種副產物，目前已知與許多疾病有密切地關聯。過氧化氫 (Hydrogen peroxide，H2O2) 是其中一種常見的ROS。在生理學上，過氧化氫是一種訊號因子，參與許多體內的調節過程以及進行蛋白質的折疊等。然而，過多的累積會造成細胞損傷甚至凋零。因此，在細胞研究中能即時、快速且具一定靈敏性的檢測ROS是一件重要的事情。然而因為細胞環境中含有許多複雜分子像是蛋白質等，會嚴重干擾量測，使得定量活性氧化物質至今仍是一大挑戰。在本研究中，我們結合瓊脂糖凝膠與奈米粒子，開發基於酵素免疫沉澱的局部表面電漿共振 (Localized surface plasmon resonance， LSPR) 感測器。在本研究中，瓊脂糖凝膠成膠後會形成有孔隙的網狀物，能將分子量較大的物質有效阻絕在凝膠外，進而降低干擾物的影響，無須額外的純化步驟，我們能在細胞培養基 (Dulbecco's modified eagle medium, DMEM) 與胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 之複雜溶液中有效檢測出過氧化氫濃度低至 0.5 M。我們也成功量測到細胞受到藥物刺激後，所產生的過氧化氫濃度變化。相信在細胞研究領域中，可望成為一項有力的檢測方法。

Reactive oxygen species (ROS), a by-product of aerobic metabolism, are currently known as high relationship with many diseases. Hydrogen peroxide (H2O2) is a kind of common reactive oxygen species. H2O2 is the signal transduction molecules involved in many in vivo regulation processes and protein folding. However, the excessive accumulation of H2O2 will cause cell damage and even death. Therefore, monitoring ROS level by a simple, fast and sensitive way of measurement is an important thing in cell biology study. However, there is still a huge challenge due to many complex molecules, such as proteins, in cellular culture environment. In this work, we combine agarose gel and noble metal nanoparticles to develop an enzymatic catalysis based localized surface plasmon resonance (LSPR) biosensor. Agarose as a porous network material can effectively block big molecules. Without extra purification process, we can effectively detect H2O2 down to 0.5 M in Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) with fetal bovine serum (FBS). We also successfully measured the change of H2O2 level over time after cell stimulated by the drug. We expect that will become a valuable detection method in cell research field.

目錄
致謝---------------------1
摘要---------------------2
Abstract ----------------3
目錄---------------------4
圖目錄-------------------5
第1章 研究背景------------7
1.1 前言-----------------7
1.2 局部表面電漿共振------8
1.3 現有檢測方法及挑戰----11
1.3.1 比色法-------------11
1.3.2 電化學法-----------13
1.3.3 局部表面電漿共振法--16
1.3.4 表面增強拉曼光譜法--18
1.4 凝膠介紹-------------19
1.5 研究動機-------------21
第2章 材料與方法---------24
2.1 實驗材料-------------24
2.2 實驗儀器-------------25
2.3 凝膠基板實驗架設------25
2.4 凝膠基板製作---------26
2.5 細胞培養-------------29
第3章 實驗結果與討論------30
3.1 基板穩定性&重複性-----30
3.2 AEC濃度參數優化------32
3.3 辣根過氧化物濃度參數優化------35
3.4 凝膠濃度參數優化-----37
3.5 複雜溶液抵抗能力測試---------40
3.6 專一性測試-----------42
3.7 細胞分泌過氧化氫之量測-------43
第4章 結論與未來展望-------47

圖目錄
圖 1-1 細胞有氧代謝產生ROS示意圖-------8
圖 1-2 過氧化氫分子示意圖-------9
圖 1-3 局部表面電漿共振示意圖。-------10
圖1-4 修飾生物辨識元件示意圖。-------11
圖1-5 LSPR的位移及光強變化示意圖。-------12
圖 1-6 (a) 過氧化氫濃度序列與奈米花溶液反應後的顏色變化-------(b) HRP奈米花自組裝示意圖12。-------13
圖 1-7 (a) 氮摻雜碳量子點上修飾LPN形成Cu 2+ 配位進行過氧化氫檢測 (b) 反應後藉由吸收光譜於652 nm的變化定量過氧化氫13。------- 14
圖 1-8 Liu等人修飾電極步驟示意圖。首先製備多孔隙石墨烯以吸附過氧化氫酶，再進一步修飾於電極上16。-------15
圖 1-9 Shim等人修飾電極步驟示意圖。藉由在電極上修飾導電聚合物以吸附金屬離子形成枝晶，再通過蝕刻形成多孔隙結構19。-------16
圖 1-10 Shim等人以電化學法檢測細胞分泌過氧化氫之結果。 (a) 分別比較沒有細胞、正常細胞以及癌細胞受藥物PMA刺激後隨時間變化。 (b) 比較正常細胞以及癌細胞受同一藥物刺激的表現19。-------17
圖 1-11 概觀LSPR機制進行檢測之方式，包含調控奈米粒子間距及改變奈米粒子形狀、大小等24。-------17
圖 1-12 (a) 奈米金粒與銀粒的混和溶液受過氧化氫蝕刻的光譜變化，其中奈米金粒不會受到蝕刻影響而作為內標校正誤差 (b) 以奈米金粒與銀粒的吸收峰值的光強比值定量過氧化氫27。-------18
圖 1-13 將4-CA分子修飾於奈米金粒上作為拉曼探針，通過分子轉化後拉曼光譜改變來檢測過氧化氫30。-------20
圖 1-14 將3-MPBA分子修飾於奈米金粒上作為拉曼探針 (a) 與過氧化氫發生反應，3-MPBA分子轉變成3-HTP (b) 修飾3-HTP之奈米金粒 (紅線) 與修飾3-MPBA反應前後 (綠線、藍線) 之拉曼光譜比較31。-------20
圖 1-15 (a) 不同PEGDA凝膠濃度所製作的SERS基板對於大分子阻擋能力之示意圖 (b) 量測含有BSA及酵母分子的阿斯匹靈溶液之拉曼光譜，分別對應於(a)中的SERS基板38。-------22
圖 2-1 凝膠基板光路架設示意圖。-------27
圖 2-3 凝膠基板製作示意圖。-------28
圖 2-4 酵素免疫沉澱反應示意圖。AEC分子在含有過氧化氫的環境下受HRP催化產生沉澱物。-------29
圖 3-1 有無混和 gel 的基板光譜及奈米金棒液態光譜比較。-------32
圖 3-2 不同凝膠基板的吸收光譜表現。分別為1~5組不同凝膠基板的吸收峰值，並取5個隨機位置所量測而得的標準差作為誤差線。(n=5)-------32
圖 3-3 多次基板光譜表現。黑線為奈米金棒液態光譜，其他則為不同批次基板製作所量測的基板光譜。-------33
圖 3-4 比較不同AEC濃度對於基板光譜峰值位置的影響 (n=5)。 (AEC濃度分別為 0.0625%、0.125%、0.25%，HRP濃度為 1.25 g/ml，凝膠濃度為 1.5%)-------34
圖 3-5 比較不同AEC濃度與吸收光譜位移的關係。 (AEC濃度分別為 0.0625%、0.125%、0.25%，HRP濃度為 1.25 g/ml，凝膠濃度為 1.5%)-------35
圖 3-6 比較不同HRP濃度對於基板光譜峰值位置的影響 (n=5)。 (HRP濃度分別為 0.125 g/ml、1.25 g/ml、12.5 g/ml，AEC濃度為 0.125 ，凝膠濃度為 1.5%)-------37
圖 3-7 HRP濃度與吸收光譜位移關係圖。(HRP濃度分別為 0.125 g/ml、1.25 g/ml、12.5 g/ml，AEC濃度為 0.125 ，凝膠濃度為 1.5%)-------37
圖 3-8 瓊脂糖凝膠於臨界點乾燥後之掃描電子顯微鏡影像，確認凝膠濃度與孔隙大小的關係 (scale bar：5 m)。凝膠濃度分別為 (a) 1.5 %、(b) 3 %、(c) 5 %。-------40
圖 3-9 比較不同凝膠濃度對於基板光譜峰值位置的影響 (n=5)。(凝膠濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%，AEC濃度為 0.125 ，HRP濃度為 1.25 g/ml)-------40
圖 3-10 凝膠濃度與吸收光譜位移關係圖。(凝膠濃度分別為1%、1.5%、2%、2.5%，AEC濃度為 0.125 ，HRP濃度為 1.25 g/ml)-------41
圖 3-11複雜溶液下凝膠基板對於過氧化氫濃度序列量測之結果。(凝膠濃度為1.5%，AEC濃度為 0.125 ，HRP濃度為 1.25 g/ml)-------42
圖 3-12 專一性測試 (n=5)。(依序分別為glucose (GLU)、ascorbic acid (AA)、glutathione (GSH)、dopamine (DA)、uric acid (UA) (濃度均為 100 M))-------43
圖 3-13 不同濃度抗壞血酸對於過氧化氫檢測的影響。 (a) 對於量測10 M 過氧化氫的位移影響 (b) 對於量測1 M 過氧化氫的位移影響。-------44
圖 3-14 比較A549細胞有無AA刺激在0-150秒的量測結果。(each group n=3) (A549+/- 表示有無A549細胞的情況，AA+/- 表示有無加入抗壞血酸)-------46
圖 3-15 觀察有無AA刺激及細胞實驗前後，A549細胞的型態變化。(scale bar: 100 m)-------47

1. M. P. Murphy, Biochem. J., 2009, 417, 1-13.
2. S. Yang, Y. Han, J. Liu, P. Song, X. Xu, L. Zhao, C. Hu, L. Xiao, F. Liu and H. Zhang, Curr. Med. Chem., 2017, 24, 3185-3202.
3. Y. Jin, K. H. Wong and A. M. Granville, Colloids Surf., B, 2016, 492, 100-109.
4. T. Y. Jeon, D. J. Kim, S. G. Park, S. H. Kim and D. H. Kim, Nano Converg., 2016, 3, 18.
5. P. Chen and B. Liedberg, Anal. Chem., 2014, 86, 7399-7405.
6. H. Jang, C. H. Kwak, G. Kim, S. M. Kim, Y. S. Huh and T.-J. Jeon, Microchim. Acta, 2016, 183, 2649-2654.
7. G. K. Joshi, S. Deitz-McElyea, M. Johnson, S. Mali, M. Korc and R. Sardar, Nano Lett., 2014, 14, 6955-6963.
8. H. M. Hiep, T. Endo, K. Kerman, M. Chikae, D.-K. Kim, S. Yamamura, Y. Takamura and E. Tamiya, Sci. Technol. Adv. Mater., 2007, 8, 331-338.
9. J. Hu, K. Fu and P. W. Bohn, Anal. Chem., 2018, 90, 2326-2332.
10. Q. Jiang, Y. J. Chandar, S. Cao, E. D. Kharasch, S. Singamaneni and J. J. Morrissey, Adv. Biosys., 2017, 1.
11. G. Cappi, F. M. Spiga, Y. Moncada, A. Ferretti, M. Beyeler, M. Bianchessi, L. Decosterd, T. Buclin and C. Guiducci, Anal. Chem., 2015, 87, 5278-5285.
12. Z. Lin, Y. Xiao, Y. Yin, W. Hu, W. Liu and H. Yang, ACS Appl. Mater. Inter., 2014, 6, 10775-10782.
13. D. Zhang, X. Mao, Z. Zhang, S. Zhang, J. Chen, D. Shan and X. Lu, Sens. Actuator B-Chem., 2019, 284, 684-694.
14. L. Wang and E. Wang, Electrochem. Commun., 2004, 6, 225-229.
15. P. Das, M. Das, S. R. Chinnadayyala, I. M. Singha and P. Goswami, Biosens. Bioelectron., 2016, 79, 386-397.
16. Y. Liu, X. Liu, Z. Guo, Z. Hu, Z. Xue and X. Lu, Biosens. Bioelectron., 2017, 87, 101-107.
17. W. Hooch Antink, Y. Choi, K.-d. Seong and Y. Piao, Sens. Actuator B-Chem., 2018, 255, 1995-2001.
18. Y. Zhao, D. Huo, J. Bao, M. Yang, M. Chen, J. Hou, H. Fa and C. Hou, Sens. Actuator B-Chem., 2017, 244, 1037-1044.
19. M. H. Naveen, N. G. Gurudatt, H.-B. Noh and Y.-B. Shim, Adv. Funct. Mater., 2016, 26, 1590-1601.
20. B. Lee, J. H. Park, J. Y. Byun, J. H. Kim and M. G. Kim, Biosens. Bioelectron., 2018, 102, 504-509.
21. S. Wu, S. Y. Tan, C. Y. Ang, Z. Luo and Y. Zhao, Chem. Commun., 2016, 52, 3508-3511.
22. K. Tan, G. Yang, H. Chen, P. Shen, Y. Huang and Y. Xia, Biosens. Bioelectron., 2014, 59, 227-232.
23. V. Pavlov, Y. Xiao and I. Willner, Nano Lett., 2005, 5, 649-653.
24. L. Tang and J. Li, ACS Sens., 2017, 2, 857-875.
25. Z. Zhang, H. Wang, Z. Chen, X. Wang, J. Choo and L. Chen, Biosens. Bioelectron., 2018, 114, 52-65.
26. G. Shan, S. Zheng, S. Chen, Y. Chen and Y. Liu, Colloids Surf., B, 2013, 102, 327-330.
27. P. J. Rivero, E. Ibañez, J. Goicoechea, A. Urrutia, I. R. Matias and F. J. Arregui, Sens. Actuator B-Chem., 2017, 251, 624-631.
28. M. Fleischmann, P. J. Hendra and A. J. McQuillan, Chem. Phys. Lett., 1974, 26, 163-166.
29. M. Moskovits, Rev. Mod. Phys., 1985, 57, 783-826.
30. L. L. Qu, Y. Y. Liu, S. H. He, J. Q. Chen, Y. Liang and H. T. Li, Biosens. Bioelectron., 2016, 77, 292-298.
31. X. Gu, H. Wang, Z. D. Schultz and J. P. Camden, Anal. Chem., 2016, 88, 7191-7197.
32. H. R. Culver, J. R. Clegg and N. A. Peppas, Acc. Chem. Res., 2017, 50, 170-178.
33. X. Wei, T. Tian, S. Jia, Z. Zhu, Y. Ma, J. Sun, Z. Lin and C. J. Yang, Anal. Chem., 2016, 88, 2345-2352.
34. Z. Zhu and C. J. Yang, Acc. Chem. Res., 2017, 50, 22-31.
35. K. F. Lei, T. K. Liu and N. M. Tsang, Biosens. Bioelectron., 2018, 100, 355-360.
36. K. F. Lei, C. H. Chang and M. J. Chen, ACS Appl. Mater. Inter., 2017, 9, 13092-13101.
37. D. J. Kim, T. Y. Jeon, Y.-K. Baek, S.-G. Park, D.-H. Kim and S.-H. Kim, Chem. Mater., 2016, 28, 1559-1565.
38. D. J. Kim, T. Y. Jeon, S. G. Park, H. J. Han, S. H. Im, D. H. Kim and S. H. Kim, Small, 2017, 13, 1604048.
39. D. J. Kim, S. G. Park, D. H. Kim and S. H. Kim, Small, 2018, 14, 1802520.
40. Y. Zhao, Y. Hu, J. Hou, Z. Jia, D. Zhong, S. Zhou, D. Huo, M. Yang and C. Hou, J. Electroanal. Chem., 2019, 842, 16-23.
41. W. Zhang, G. Fan, H. Yi, G. Jia, Z. Li, C. Yuan, Y. Bai and D. Fu, Small, 2018, 14, 1703713.
42. S. Park, Nutrients, 2013, 5, 3496-3505.
43. Q. Chen, M. G. Espey, A. Y. Sun, C. Pooput, K. L. Kirk, M. C. Krishna, D. B. Khosh, J. Drisko and M. Levine, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105, 11105-11109.