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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:沈昊憫
研究生(外文):HAO-MIN SHEN
論文名稱:以融合蛋白形式異源表現真核分泌型小分子量蛋白於大腸桿菌中
論文名稱(外文):Heterologous expression in Escherichia coli of an eukaryotic secretory low-molecular-weight protein in the form of a fusion protein
指導教授:官宜靜
指導教授(外文):I-Ching Kuan
口試委員:官宜靜
口試委員(外文):I-Ching Kuan
口試日期:2020-07-31
學位類別:碩士
校院名稱:大同大學
系所名稱:化學工程與生物科技學系(所)
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2020
畢業學年度:108
語文別:中文
論文頁數:87
中文關鍵詞:內含蛋白表皮生長因子信號胜肽
外文關鍵詞:inteinEGFVMA.GyrA
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原核系統表現重組蛋白雖已廣泛應用於食品、醫藥和化工領域,但是如何提升蛋白質產量和有效率地進行純化仍然為研究的重心。本研究將一真核分泌型小分子量蛋白質B、表皮生長因子(E)和Saccharomyces cerevisiae VMA內含蛋白(V)藉由基因工程操作,表現形成融合蛋白,以增加表現量,並欲運用內含蛋白的自行剪切能力,獲得不具N端甲硫氨酸的蛋白質B。為了提升蛋白質表現量,將融合基因分別建構於pET23a、pET22b、pQE70m3或pUC19後,轉形至E. coli BL21(DE3)或JM110,誘導生產重組蛋白,並以SDS-PAGE分析檢視蛋白表現情形。
藉由建構不同組合的融合基因、調整誘導溫度、培養液種類、誘導菌體濃度或誘導劑濃度,試圖尋找最佳的蛋白質表現條件。不過目前嘗試的方法所產生的融合蛋白均表現為內涵體,其中以帶有重組pET23a-EVB的E. coli BL21(DE3)以TB培養,並在25oC下誘導表現時,產生較多的融合蛋白。
Although recombinant proteins expressed from prokaryotic systems have been widely used in the fields of food, medicine, chemical engineering, How to increase protein production and efficient protein purification are still the focus of research. In this study, an eukaryotic secretory low-molecular-weight protein B (B), epidermal growth factor (E) and Saccharomyces cerevisiae VMA intein (V) were expressed as a fusion protein via genetic engineering manipulation to increase expression level, and obtain protein B without N-terminal methionine through inteins’ self-cleavage ability. To improve the protein expression, the fusion genes were constructed onto pET23a, pET22b, pQE70m3 or pUC19, and transformed into E. coli BL21(DE3) or JM110, for induction of recombinant proteins, followed by SDS-PAGE analysis to examine the protein expression level.
To obtain the optimal conditions for protein expression by constructing different combinations of fusion genes, adjusting the induction temperatures, types of culture media, cell concentrations for induction or inducer concentrations. Nevertheless, the fusion proteins produced by the methods used were all inclusion bodies. pET23a-EVB-carrying recombinant E. coli BL21(DE3) when grown in TB and induced at 25oC showed more fusion protein expression.
誌謝 i
摘要 ii
ABSTRACT iii
目錄 iv
第一章 前言 5
1.1 內含蛋白 5
1.1.1簡介 5
1.1.2結構特徵 5
1.1.3蛋白質剪接機制 5
1.1.4剪接控制 5
1.1.5 Saccharimyces cerevisiae VMA內含蛋白 5
1.1.6 Mycobacterium xenopi GyrA內含蛋白 5
1.2 重組蛋白質表現 5
1.2.1 原核表現系統 5
1.2.2 表達載體和宿主菌 5
1.2.3 表現蛋白的折疊 10
1.3 信號胜肽 11
1.4 研究目的 12
第二章 實驗材料與方法 13
2.1 菌株 13
2.2 勝任細胞製備 13
2.2.1試劑 13
2.2.2製備 14
2.3 重組質體的建構 15
2.3.1 質體 15
2.3.2 融合基因 15
2.3.3 聚合酶連鎖反應 16
2.3.4 PCR產物和限制酶處理後的DNA純化 16
2.3.5 DNA的接合 17
2.3.6 轉形作用(transformation)和菌種保存 18
2.3.7 菌落聚合酶連鎖反應(Colony PCR) 19
2.4 質體的抽取 20
2.5 Gibson assembly 21
2.6 誘導表現 22
2.6.1培養基 22
2.6.2搖瓶培養 24
2.7 SDS-PAGE 25
2.7.1製膠 25
2.7.2蛋白質樣品製備 26
2.7.3蛋白質電泳 27
2.8 內含蛋白的純化 29
2.8.1 試劑 29
2.8.2 樣品處理 30
2.8.3 管柱預處理 30
2.8.4 純化步驟 31
2.8.5 管柱的清洗 31
第三章 結果與討論 32
3.1 重組表現質體之建構 32
3.1.1 pET23a-EVB和pET23a-VB 32
3.1.2 pET22b-OEVB和pET22b-EVB 33
3.1.3 pET28c-EVB 33
3.1.4 pET23a-GB 33
3.1.5 pQE70m3-GB和pUC19-GB 34
3.2 融合蛋白於E. coli的異源表現 35
3.2.1 帶有pET23a-OEVB、pET23a-EVB和pET23a-VB E. coli的異源表現 35
3.2.2 帶有pET22b-OEVB和pET22b-EVB E. coli的異源表現 36
3.2.3 帶有pET28c-EVB E. coli的異源表現 36
3.2.4 帶有pET23a-GB E. coli的異源表現 37
3.2.5 帶有pQE70m3-GB E. coli的異源表現 37
3.2.6帶有pUC19-GB E. coli的異源表現 37
3.3 帶有His tag EVB融合蛋白的純化和in vitro剪切處理 38
第四章 結論 40
第五章 圖表 42
表1.本研究所使用的DNA引子 42
圖1.內含蛋白的剪接。引自Elleuche et al., 2010。 49
圖2.兩類內含蛋白的結構。引自Elleuche et al., 2010。 50
圖3.內含蛋白的剪接機制。引自Elleuche et al., 2010。 51
圖4. pET23a、pET22b、EVB和OEVB基因片段的DNA電泳分析。 52
圖5. pET23a-EVB和pET23a-VB的建構。 53
圖6. pET22b-OEVB和pET22b-EVB的建構。 54
圖7. pET28c-EVB的建構。 55
圖8. pET23a-GB的建構。 56
圖9. pQE70m3-GB的建構。 57
圖10. pUC19-GB的建構。 58
圖11.帶有pET23a-OEVB E. coli的異源表現。 59
圖12.帶有pET23a-OEVB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 60
圖13.帶有pET23a-EVB之E. coli的異源表現。 61
圖14.帶有pET23a-EVB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 62
圖15.帶有pET23a-VB之E. coli的異源表現。 63
圖16.帶有pET23a-VB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 64
圖17.帶有pET22b-OEVB之E. coli的異源表現。 65
圖18.帶有pET22b-OEVB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 66
圖19.帶有pET22b-EVB之E. coli的異源表現。 67
圖20.帶有pET22b-EVB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 68
圖21.帶有pET28c-EVB之E. coli的異源表現。 69
圖22.帶有pET28c-EVB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 70
圖23.帶有pET23a-GB之E. coli的異源表現。 71
圖24.帶有pET23a-GB E. coli胞內可溶和不可溶蛋白分析。 72
圖25.帶有pQE70m3-GB之E. coli DH5α和BL21(DE3)的異源表現。 73
圖26. 帶有pQE70m3-GB之E. coli DH5α和BL21(DE3)的胞內可溶和不可溶蛋白分析。 74
圖28. .帶有pQE70m3-GB E. coli JM110的胞內可溶和不可溶蛋白分析。 76
圖29. 帶有pUC19-GB E. coli BL21(DE3)的異源表現。 77
圖30. 帶有pUC19-GB E. coli BL21(DE3)胞內可溶和不可溶蛋白分析。 78
圖31. 帶有pUC19-GB E. coli JM110的異源表現。 79
圖32. 帶有pUC19-GB E. coli JM110的胞內可溶和不可溶蛋白分析。 80
圖33. EVB不可溶蛋白的回溶處理。。 81
圖34. 帶有His tag EVB融合蛋白的純化和in vitro剪切處理。 82
第六章 參考文獻 83
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