臺灣博碩士論文加值系統

摘 要 豐 原 素 屬 於 含 脂 質胜 太類的 抗 生 素 ，對 於 絲 狀
真 菌 的 生 長 有 抑 制 作 用 。 先 前 的 研 究 顯 示，組 成
豐 原 素 的 胜 太 鏈 共 有 十 個 胺 基 酸 ， 胜 太 鏈 的 合
成 是 以胜 太 合 成 脢利 用 nonribosomal 的 方 式 進 行 的 ，
而 每 一 個 胜 太合 成 脢 可 以 特 異 性地 結 合 受 質 胺 基
酸 ， 並 將 這 些 胺 基 酸 活 化 ，最 後 經 由 胜 太合 成 脢
的 作 用 將 這 些 活 化 態 的 胺 基 酸 連 結 成 豐 原 素 的 胜
太 鏈 。 本 論 文 主 要 的 目 的 是 研 究 完 整 的豐 原 素
胜太合成 脢fenA 之 基 因 序 列 以 及 fenA 基 因 產 物 的 功 能
。 經 由 序 列 分 析 的 結 果 可 以 知 道 全 長 的 fenA 基 因 共
有 10,513 bp ， 其 基 因 產 物 為 一 胜 太 合 成 脢， 可 以 特
異 性 的 結 合 三 個 受 質 胺 基 酸 。在 FenA 的 組 成 中 共 有
三 個 活 化 區 域 ， 分 別 是 FenAA, FenAB, FenAC ， 每 一 個 區
域 又 可 分 為 四 個 高 保 守 區 域 (conserve region) ， 分 別
是 spacer, ATP binding, ATPase, 以 及 pan-binding 高 保 守 區
域 。 同 時 從 GenBank 的 序 列 比 較 中， 尚 可 發 現 FenAA
的 胺 基 酸 組 成 與 SrfAC 的 相 似 度 為 32.8% ， FenAB的 組
成 與 TyrA 的 相 似 度 為 33.7% ， FenAC組 成 與 GrsA的 相 似
度 為 34.9%。另 外 ， 本 文 中 將 fenA 基 因 的 第 三 個 區 域
fenAC 選殖 出 來 ， 並 且 將 fenAC 大 量 表 現 於 Escherichia
coli. 中，同 時 利 用 His? taq 親 和 性 管 柱 純 化 表 現 後
的 FenAC 蛋 白 質， 接 著 將 純 化 後 的 FenAC 蛋 白 質 分 別 和
二 十 二 種 胺 基 酸 混 合 ， 並 加 入 含 有 [32P]sodium
pyrophosphate 以 及 ATP 的 反 應 緩 衝 液 ， 結 果 顯 示 只 有
alanine 才 能 使 FenAC 將 放 射 性 標 定 的 雙 磷 酸 根 置 換 進
入 ATP 中 ， 形 成 具 有 放 射 性 的 ATP ， 其 結 果 證 明
FenAC 可 以 結 合 及 活 化 alanine 。 從 其 他 實 驗 室 的 的 研
究 報 告 得 知 ， 目 前 已 知 的 胜 太 合 成 脢基 因 中 ， 最 後
一 個胺 基 酸 結 合 區 域 均 含 有 一 個 胺 基 酸 消 旋 異 構
區 ， 這 結 果 顯 示 出 此 區 域 除 了 將 L-型 的 受 質 胺 基
酸 轉 變 成 為 D-型 ， 尚 可 以 把 合 成 的 胜 太 鏈由 第 一 個
酵 素 轉 移 至 另 一 個 酵 素 上 ，而 相 同 的胺 基 酸 消 旋
異 構 高 保 守 區域 ， 在FenAC 的 C 端 中 也 可 以 發 現 ，
因 此 可 以 推 測 FenAC 是胜 太 合 成 脢 FenA 的 最 後 一 個 胺
基 酸 結 合 區 域 。 在 fenA 基 因 之 中 共 有 七 個 Tn917lux 的
插 入 位 置 ， 而 分 析 其 中 的 兩 株 突 變株 FS22 及 FS24 的
螢 光 基的 表 現 ， 從 結 果 顯 示 這 兩 株 突 變 株的 螢 光 基
因 表 現 均 位 於 stationary 時 期 ， 因 此 fenA 啟 動 子 的表
現 也 應 在 這 個 時 期 。因 此 若 將 特 定 的 胜 太 脢 合 成
區 域 組 成 一 個 人 工 的 胜太 合 成 脢 ， 將 可 利 用 此 酵 素
合 成 一 些 特 定 的 胜 太 鏈 ， 而 了 解 fenA 的 基 因 結 構 及
功 能 將 有 助 於 此 目 標 的 達 成 。

AbstractFengycin is a lipopeptide which exhibits a broad
spectrum of antifungal activity. Previous studies have shown
that fengycin peptide consists of 10 amino acids and is
synthesized nonribosomally by peptide synthetases. These peptide
synthetases can bind to and activate specific amino acids. These
activated amino acids are then linked together by the action of
the enzymes to form the fengycin peptide. The purpose of this
study was to characterize the gene, fenA, which encodes the
peptide synthetase, FenA. Sequencing analysis revealed that fenA
has a length of 10,513 bp and encodes a peptide synthetase, FenA
which can activate three amino acids. Each of the three amino
acid activation modules (FenAA, FenAB, FenAC) of FenA contains
conserved spacer, ATP-binding, ATPase, and pantetheinin-binding
domains. The sequence similarities between FenAA and the SrfAC
module of surfactin synthetase, FenAB and the TyrA module of
tyrocidine synthetase, FenAC and the GrsA module of gramicidin S
synthetase are 32.8%, 33.7%, and 34.9%, respectively. I have
also cloned and overexpressed the fenAC module of fenA in
Escherichia coli. The expressed protein was purified by His-tag
affinity chromatography. The purified protein was incubated with
one of the twenty amino acids in a reaction mixture containing
[32P]sodium pyrophosphate and ATP. Results showed that only
alanine was able to promote the pyrophosphate exchange between
sodium pyrophosphate and ATP, indicating that the function of
FenAC is responsible for the activation of alanine. Studies
reported by other laboratory showed that the last amino acid
activation module of all the peptide synthetases studied so far
consists of a racemase domain, indicating that this domain is
required not only for the conversion of L-amino acid to D-amino
acid but also for the translocation of the peptide translocation
from one enzyme to the other enzyme. I found that a conserved
racemase region is also present at the end of FenAC, showing
that FenAC is the last module of FenA synthetase. I have also
determined the locations of the seven Tn917lux insertions in
fenA and analyzed the expression of fenA by monitoring the
luciferase activity exhibited by two of the Tn917lux mutants,
FS22 and FS24. Results showed that the luciferase was expressed
during the stationary phase, suggesting that the promoter which
transcribes fenA is activated during the stationary phase. Since
it is possible to generate artificial peptide synthetases
consisting of different amino acid modules for the synthesis of
a specific peptide, the understanding of the structure and the
function of fenA will help us to achieve this goal.