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研究生:徐銘豊
研究生(外文):Min-Feng Hsu
論文名稱:樟芝(Antrodiacamphorata)液態培養生產(1→3)-β-D-glucan多醣體之研究探討
論文名稱(外文):Preparation of ( 1→3)-β-D-glucan from submerged cultivation of Antrodia camphorata
指導教授:曾耀銘曾耀銘引用關係
指導教授(外文):Yew-Min Tzeng
學位類別:碩士
校院名稱:朝陽科技大學
系所名稱:生物技術研究所
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文出版年:2006
畢業學年度:94
語文別:中文
論文頁數:80
中文關鍵詞:樟芝多醣體(1→3)-β-D-glucan
外文關鍵詞:Antrodia camphoratapolysaccharides(1→3)-β-D-glucan
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樟芝(Antrodia camphorata)是台灣特有且極為昂貴的藥用真菌,近年來已有多份研究報告指出樟芝具有提升免疫機能、抑制腫瘤細胞的功能。樟芝液態培養乃目前主要的培養方式,可在短時間、有限空間下生產大量樟芝菌絲體,極具有商業經濟發展能力。

本研究以樟芝液態發酵培養菌絲並利用化學萃取方式,萃取大量的(1→3)-β-D-glucan。實驗先以BCRC 35396、35398、及35716等三株菌(皆購自食工所),比較各菌株測試結果實驗菌株以BCRC 35398所得結果較佳,其發酵液所產孢外多醣可為1.01 mg/mL、菌絲體乾重1.95 mg/mL、細胞數6.22×105 #/mL、(1→3)-β-D-glucan 0.29 mg/mL。分別使用層析儀與染色法所得BCRC 35398之高分子區域之MW:1,425,633的高分子醣類占總醣中的比例為3.1%。化學萃取程序所純化之(1→3)-β-D-glucan為凝膠結構,經過適當的處理後能夠清楚的分辨(1→3)-β-D-glucan各個碳的化學位移,C-1:為103.140 ppm、C-3:為86.250 ppm、C-5:為76.415 ppm、C-2:為72.930 ppm、C-4:為68.490 ppm、C-6:為60.958 ppm。
Antrodia camphorata is a peculiar and extremely expensive medical fungi in Taiwan. Recent studies on these fungi shown to have various biological activities including modulation of immune response and inhibition of tumor growth. Now submerged cultures can produce a large number of mycelium under short time and limited space, so it is still the major mode to culture and have commercial economic development ability very much. In this study, we used submerged cultivation to produce the mycelium, and its extraction and chemical purification from the different strains i.e. BCRC 35396, BCRC 35398 and BCRC 35716 of A. camphorata. The results indicated that the strain BCRC 35398 is better than the others where the extracellular polysaccharides concentration is 1.01 mg/mL, mycelium dry weight is 1.95 mg/mL, cell number is 6.2×105 and the (1→3)-β-D-glucan is 0.29 mg/mL, respectively. Although, the BCRC 35398 strain is better than the others, however, BCRC 35398’s (1→3)-β-D-glucan transform rate is better. We found that the BCRC 35398 produced extracellular polysaccharide has molecular weight is 1,425,633 and the percentage is 3.1 % in total carbohydrate by using gel filtration chromatography and dyeing method. Through the chemical extraction method, we found that (1→3)-β-D-glucan is the curdlan. In the 13C-NMR spectra, the chemical shift values of (1→3)-β-D-glucan were as follows: C-1 at 103.140 ppm, C-2 at 76.415 ppm, C-3 at 86.250 ppm, C-4 at 68.490 ppm, C-5 at 76.415 ppm and C-6 at 60.958 ppm, respectively.
目錄

摘要……………………………………………………………….……Ⅰ
Abstract…………………………………………………………….……Ⅱ
誌謝…………………………………………………………………..…Ⅲ
目錄………………………………………………………………..……Ⅴ
表目錄………………………………………………………………..…Ⅷ
圖目錄……………………………………………………………..……Ⅸ

壹、 樟芝文獻回顧
1-1 樟芝的分類與型態……………………...……………………1
1-2 樟芝的生理活性…………………………………………...…5
1-3 (1→3)-β-D-glucan
1-3-1 (1→3)-β-D-glucan的抗腫瘤活性………………...………8
1-3-2 (1→3)-β-D-glucan的特性………...….……………….…10
1-4 (1→3)-β-D-glucan的萃取方式….…………………………14
1-5 研究範圍與目的…………………………………………….19

貳、材料與方法
2-1-1 實驗材料與設備…………………………………….....…20
2-1-2 菌種來源及菌種保存……………..…………………...…20
2-1-3 前培養………………………………………………….…21
2-1-4 主培養………………………………………………….…21
2-2多醣純化之材料與方法
2-1 前言……………………………………………...………..…22
2-2 材料與設備……………………………………………….…22
2-2-1 發酵液粗多醣萃取………….………………………….…23
2-2-2 菌絲粗多醣萃取…………………………….………….…23
2-2-3 粗多醣純化……………………………………………..…24
2-2-4 多醣純化與製備……………………………………..……24
2-3多醣之分析
2-3-1 酚-硫酸法測定總醣…………………..….…………….…25
2-3-2 苯胺藍(aniline blue)螢光染色……………….……….…26
2-4 多醣體之層析法………………….….………………....……30
2-4-1實驗材料與儀器………………………………….…..........32
2-4-2 Gel Filtration Chromatography分析………….………...…32
2-4-3 HPLC-ELSD 分析……………………………………..….33
2-5 核磁共振光譜(Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer)分析………………………………..…………34
参、結果與討論
3-1 菌種篩選……………..………………….………………..…35
3-2 分子量的分布….…………..……………….…….…………40
3-3 多醣體的萃取純化…………………..…….……………..…47
3-4 NMR鑑定純化產物…………………………………………54

肆、結論與未來展望……………………………………………..…58
參考文獻……………………………………………………...…….…66
附錄…………………………………………………………...……..…73
作者簡歷………………………………………………………………80










表目錄

表一、近兩年樟芝研究報告之整理…………………………………..…7
表二、不同菌種之比較表………………………………………………39
表三、不同菌種發酵液(1→3)-β-D-glucan含量………………….…39
表四、利用苯胺藍染色法鑑定不同溶劑的萃取率……………………44
表五、利用苯胺藍染色法鑑定不同萃取時間的萃取率………………49
表六、利用苯胺藍染色法鑑定萃取次數萃取率………………………50
表七、利用苯胺藍染色法鑑定熱水萃取的萃取率與
所得樣品之重量………………………………..………………50
表八、不同萃取方式所獲得之產物量…………………………………53
表九、不同萃取方式所獲得之產物量的(1→3)-β-D-glucan濃度.…53
表十、整理文獻所得高分子多醣體之化學位移位置…………………57







圖目錄

圖一、樟芝子實體………………………………………………………..3
圖二、樟芝液態發酵之孢子…………………………………..…………4
圖三、裂褶菌多醣代表性的結構圖………………….…..…….………12
圖四、(1→6)branched(1→3)-β-D-glucan結構式……………….….13
圖五、酵母細胞壁假設圖………………………….…...………………15
圖六、菌絲體萃取步驟概要……………………………………………18
圖七、Sirofluor結構…………………………………….…...………….27
圖八、大小排除層析管柱的校正曲線…………………….…………..31
圖九、酚-硫酸法標準曲線……………………………………...………37
圖十、苯胺藍(aniline blue)螢光染色法標準曲線…………………….38
圖十一、膠體過濾層析不同分子量的標準品polymer standards
(MW:323,000/940,000/1,310,000/2,260,000)的分子
量標準曲線………………………………………………..…42
圖十二、BCRC 35398樟芝液態發酵液膠體過濾層析圖譜(GFC)....43
圖十三、膠體過濾層析分子量(MW:1,310,000)標準品 polymer standards的高分子濃度標準曲線(HPLC-ELSD)……….…44
圖十四、BCRC 35398液態發酵液濃度之HPLC-ELSD層析圖譜…45

圖十五、BCRC 35398樟芝液態發酵液膠體過濾層析圖譜(HPLC-ELSD)……………………………………………..…46
圖十六、使用0.5 M NaOH萃取酒精沉澱法萃取後之產物的氫譜
(200 MHz, DMSO)…………………..………….…..……....51
圖十七、不同萃取方式的步驟…………………………………………52
圖十八、(1→3)-β-D-glucan標準品之 13C NMR圖譜
(200 MHz, DMSO)…………………………………..…..….60
圖十九、熱水萃取後的產物B之 13C NMR圖譜(200 MHz, DMSO).61
圖二十、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之13C NMR圖譜
(200 MHz, DMSO)…………...……...………...…………....62
圖二十一、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之1H NMR圖譜
(500 MHz, DMSO)…………...……...………...…………....63
圖二十二、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之13C NMR圖譜
(500 MHz, DMSO)…………...……...………...…………....64
圖二十三、熱水萃取後產物B經過酸水解處理之HSQC圖譜
(500 MHz, DMSO)…………...……...………...…………....65
捌、參考文獻

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