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研究生:謝宗志
研究生(外文):Tsung-Chih Hsieh
論文名稱:人工栽培牛樟芝子實體及其對肝癌細胞株(HepG2)之影響
論文名稱(外文):Manipulate the formation of Taiwanofungus camphoratus fruiting bodies and theirs effects on human hepatocellular carcinoma cell lines (HepG2)
指導教授:吳宗正吳宗正引用關係
指導教授(外文):Tzong-Zeng Wu
學位類別:碩士
校院名稱:國立東華大學
系所名稱:生物技術研究所
學門:生命科學學門
學類:生物學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2007
畢業學年度:95
語文別:中文
論文頁數:115
中文關鍵詞:牛樟芝
外文關鍵詞:Taiwanofungus camphoratus
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牛樟芝,學名Taiwanofungus camphoratus,為台灣特有種,只生長在台灣山區特有的牛樟樹樹幹腐朽之心材內壁,其子實體生長非常緩慢且稀少。近年來,牛樟芝已證實具有治療肝病及其他方面的功效,如抗腫瘤、抗氧化能力、抗病毒、抗發炎和降血糖。目前牛樟芝仍無法以人工栽培出子實體,而以固態培養和液態培養為主。本研究的主要目的為,人工栽培出子實體並測定其對肝癌細胞株(HepG2)之影響,希望藉由細胞測試結果更加證實此子實體具有與野生子實體相等的抑癌效果。將牛樟芝菌絲作機械傷害後,每天給予液態培養的mE菌(Burkholderia cepacia,以下簡稱為mE菌)滅菌液或二次水的刺激,並維持在20-28 °C飽和溼度的環境下,能使牛樟芝發展出厚且硬實菌絲結構,其甲醇萃取物在HPLC分析下,發現與野生子實體圖譜相似。以液態靜置培養兩個月後,液面會有漂浮的菌絲,此時給予牛樟木屑的水萃液刺激後,會使液面的菌絲產生類似菌孔的結構,但此結構不會持續的增厚,若給予氣體交換2週後,菌絲會生長密集,但菌孔卻消失,此結果指出生長環境中的空氣成分會影響其生長。將含有類似菌孔結構的菌絲經甲醇萃取,在HPLC分析下,其圖譜與菌絲相似。其次,以MEA固態培養牛樟芝菌絲,使其長期生長在密閉空間後,給予空氣的刺激,在適當的溫度溼度下,能使其產生孔狀結構,且經甲醇萃取,HPLC分析後,發現具有與牛樟芝野生子實體相似的波峰訊號,此乃證明經人工出菇操作,可成功培養出子實體。將培養出之子實體經不同溶劑萃取後,進行HPLC及TLC分析比較,發現具有與野生子實體相似的有效成分。將培養出之子實體萃取後,利用HepG2細胞測試其抑癌效果,結果顯示培養皿栽培之子實體具有較佳的抑癌效果。
Taiwanofungus camphoratus, a medical mushroom known only from Taiwan as ‘niu-chang chih’ or ‘jang-jy’. It is rare and expensive because it grows only on the inner heartwood wall of the endemic evergreen Cinnamonum kanehirai and is not easily cultivated. Recently, it has been used for treatment of liver diseases and other symptoms, such as anti-tumor, anti-oxidant ability, anti-virus, anti-inflammation and lowering the blood sugar. Any attempt failed to reproduce the fruiting body of Niu-chang chih by artificial cultivation, but successfully cultured by solid-state and submerge culture for the most part. The aim of this research is to investigate the formation of T.camphoratus fruiting bodies and to determine these effects on human hepatocellular carcinoma cell lines (HepG2). Mycelia was treated with mechanical methods including B. cepacia sterilized liquid culture or ddH2O under saturated humidity at 20-28 °C. The structure of mycelia was found thickly and compactly. From HPLC profile showed the methanol extracts of these mycelia were similar to the wild fruit bodies. With liquid cultured 2 months, mycelia floated on the culture medium. Addition of water extracts of C. kanehirai wood, the pore formation was observed on the surface of mycelia and was not extended in all surface. Exposure to air for 2 weeks, the mycelia grew intensively and the pore structures disappeared. These results indicate that the air content in the growth environment can influence mycelia growth. Again, HPLC profile showed the methanol extracts of these mycelia were similar to the mycelia. Cultured mycelia with MEA medium in airtight space were given air-shock for a certain time, the pore formation was found. The HPLC and TLC profiles showed the extracts of these mycelia were similar to the wild fruit bodies. Using HepG2 cell to test the inhibiting effects of fruit bodies, the result showed that these fruit bodies had the cancer- inhibition effects. This result demonstrates that cancer-inhibition effect of the artificial fruiting bodies is close to the wild fruiting bodies.
摘要-----------------------------------------------------------------------------------Ⅰ
Abstract-------------------------------------------------------------------------------Ⅲ
目錄-----------------------------------------------------------------------------------Ⅴ
圖目錄--------------------------------------------------------------------------------Ⅸ
表目錄------------------------------------------------------------------------------XIII壹、前言--------------------------------------------------------------------------------1
貳、文獻回顧------------------------------------------------------------------------- 3
一、牛樟芝簡介--------------------------------------------------------------------3
二、牛樟芝生理活性功能--------------------------------------------------------5
(一)、抗氧化能力---------------------------------------------------------------6
(二)、保肝功能------------------------------------------------------------------7
(三)、抑菌及抗病毒能力------------------------------------------------------7
(四)、增強免疫力---------------------------------------------------------------8
(五)、抗腫瘤能力---------------------------------------------------------------8
(六)、預防心血管疾病及降血糖之相關研究----------------------------10
(七)、活體動物試驗上-------------------------------------------------------10
三、牛樟芝成分分析------------------------------------------------------------10
(一)、多醣體 (polysaccharides)---------------------------------------------11
(二)、三萜類化合物 (triterpenoids)----------------------------------------12
(三)、菌絲體與子實體成分比較-------------------------------------------14
四、牛樟芝的安全性------------------------------------------------------------17
參、目的------------------------------------------------------------------------------19
肆、MEA固態培養出菇測試-----------------------------------------------------21
一、簡介---------------------------------------------------------------------------21
二、實驗材料、儀器--------------------------------------------------------------21
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------22
(一)、MEA固態牛樟芝菌絲培養------------------------------------------22
(二)、PDA培養mE菌--------------------------------------------------------22
(三)、出菇測試----------------------------------------------------------------22
(四)、HPLC圖譜積分面積算法--------------------------------------------23
四、結果與討論------------------------------------------------------------------23
(一)、溫度及溼度的影響----------------------------------------------------23
(二)、刺激物的添加方式----------------------------------------------------24
(三)、刺激物的影響----------------------------------------------------------25
伍、MEB液態培養出菇測試-----------------------------------------------------35
一、簡介---------------------------------------------------------------------------35
二、實驗材料、儀器------------------------------------------------------------35
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------35
四、結果與討論------------------------------------------------------------------36
陸、MEA固態培養air-shock測試-----------------------------------------------45
一、簡介---------------------------------------------------------------------------45
二、實驗材料、儀器--------------------------------------------------------------45
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------45
(一)、MEA固態牛樟芝菌絲培養------------------------------------------45
(二)、air-shock出菇測試-----------------------------------------------------46
四、結果與討論------------------------------------------------------------------46
柒、HPLC分析----------------------------------------------------------------------53
一、簡介---------------------------------------------------------------------------53
二、實驗材料、儀器--------------------------------------------------------------53
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------53
(一)、萃取方法----------------------------------------------------------------53
(二)、HPLC分析--------------------------------------------------------------54
四、結果與討論------------------------------------------------------------------55
捌、TLC分析-----------------------------------------------------------------------57
一、簡介---------------------------------------------------------------------------57
二、實驗材料、儀器--------------------------------------------------------------57
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------57
(一)、萃取方法----------------------------------------------------------------57
(二)、TLC分析----------------------------------------------------------------58
四、結果與討論------------------------------------------------------------------58
捌、細胞培養與測試---------------------------------------------------------------61
一、簡介---------------------------------------------------------------------------61
二、實驗材料、儀器--------------------------------------------------------------61
三、實驗方法---------------------------------------------------------------------62
(一)、細胞培養----------------------------------------------------------------62
(三)、細胞測試----------------------------------------------------------------65
四、結果與討論------------------------------------------------------------------66
拾、討論------------------------------------------------------------------------------71
結論-----------------------------------------------------------------------------------75
參考文獻-----------------------------------------------------------------------------77
附錄-----------------------------------------------------------------------------------85
圖1-1 分子學系統樹顯示牛樟芝並非屬於Antrodia,也非屬於其他相近屬------------------------------------------------------------------------------4
圖1-2 具抗腫瘤活性的β-(1-6)分枝的β-(1-3)-D-葡聚醣化學結構-------11
圖1-3 具抗腫瘤活性的β-(1-6)分枝的β-(1-3)-D-葡聚醣三股螺蜁結晶構形(以X-ray衍射)----------------------------------------------------------12
圖1-4 Structures of fourteen compounds isolated from the fruit-body of Antrodia camphorate------------------------------------------------------13
圖1-5 Neuroprotective diterpenes from the fruiting body of Antrodia camphorat-------------------------------------------------------------------14
圖4-1 MEA固態牛樟芝菌絲培養-----------------------------------------------27
圖4-2 B. cepacia在PDA上的生長情形----------------------------------------27
圖4-3溫度與溼度之影響---------------------------------------------------------28
圖4-4 牛樟芝(左)與Burkholderia cepacia (右)共同培養-------------------29
圖4-5 以300 ml mE菌液加100 ml水配製MEA培養牛樟芝-------------29
圖4-6 添加A組刺激物培養三個月後及經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之比較圖譜-----------------------------------------------------30
圖4-7 添加B組刺激物培養三個月後及經甲醇萃取,HPLC分析後與
野生子實體之比較圖-----------------------------------------------------31
圖4-8 添加C組刺激物培養三個月後及經甲醇萃取,HPLC分析後與
野生子實體之比較圖譜--------------------------------------------------32
圖4-9 添加D組刺激物培養三個月後及經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之比較圖譜-----------------------------------------------------33
圖4-10 實驗組與野生子實體菌絲體之綜合比較圖------------------------34
圖5-1 培養初期有添加牛樟木屑水萃液(左)和無添加牛樟木屑水萃液
(右)比較圖------------------------------------------------------------------38
圖5-2 MEB液態牛樟芝菌絲搖瓶培養-----------------------------------------38
圖5-3 實驗組(大錐4)的孔狀----------------------------------------------------38
圖5-4實驗組(燒杯3)菌孔結構漂浮於液面的菌絲--------------------------39
圖5-5實驗組(小錐14)類似菌孔的結構----------------------------------------39
圖5-6實驗組(小錐9)類似菌孔的結構-----------------------------------------39
圖5-7實驗組(小錐14)給予適當氣體交換14天後,菌絲生長密集但菌孔
消失--------------------------------------------------------------------------40
圖5-8實驗組(小錐19)給予適當氣體交換14天後,菌絲生長密集但菌孔
消失--------------------------------------------------------------------------40
圖5-9實驗組(大錐6)給予適當氣體交換14天後,菌絲生長密集---------41
圖5-10實驗組(大錐9)給予適當氣體交換14天後,菌絲生長密集-------41
圖5-11實驗組(大錐10)給予適當氣體交換14天後,菌絲生長密集------41
圖5-12實驗組(燒杯3)含類似菌孔的菌絲,經甲醇萃取,HPLC分析後之圖譜---------------------------------------------------------------------42
圖5-13實驗組(大錐4)含類似菌孔的菌絲,經甲醇萃取,HPLC分析後之圖譜---------------------------------------------------------------------42
圖5-14實驗組(小錐14)含類似菌孔的菌絲較黃薄的部分,經甲醇萃取,HPLC分析後之圖譜----------------------------------------------------43
圖5-15實驗組(小錐14)含類似菌孔的菌絲較紅厚的部分,經甲醇萃取,HPLC分析後之圖譜------------------------------------------------------43
圖5-16實驗組與野生子實體菌絲體之綜合比較圖--------------------------44
圖6-1 孔狀結構---F1--------------------------------------------------------------48
圖6-2 孔狀結構---F2--------------------------------------------------------------48
圖6-3 孔狀結構---F3--------------------------------------------------------------49
圖6-4 孔狀結構---F4--------------------------------------------------------------49
圖6-5實驗組F1孔狀結構,經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之
比較圖譜--------------------------------------------------------------------50
圖6-6實驗組F2孔狀結構,經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之比較圖譜--------------------------------------------------------------------50
圖6-7實驗組F3孔狀結構,經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之比較圖譜--------------------------------------------------------------------51
圖6-8實驗組F4孔狀結構,經甲醇萃取,HPLC分析後與野生子實體之比較圖譜--------------------------------------------------------------------51
圖6-9與野生子實體菌絲體之綜合比較圖------------------------------------52
圖6-10畫紅線處為去除parafilm, 使只有紅線區的菌絲受到空氣的刺激,進而發展出孔狀結構------------------------------------------------52
圖7-1 實驗組以不同溶劑萃取,HPLC 分析後,與野生子實體之比較圖譜-----------------------------------------------------------------------------55
圖7-2 S廠商以不同溶劑萃取,HPLC 分析後,與野生子實體之比較圖譜-----------------------------------------------------------------------------56
圖7-3 松杉靈芝以不同溶劑萃取,HPLC 分析後,與野生子實體之比較圖譜--------------------------------------------------------------------------56
圖8-1 樣品以不同溶劑萃取,TLC分析後之比較圖------------------------60
圖9-1 野生子實體不同溶劑萃取物,對肝癌細胞的細胞抑制率---------68
圖9-2 實驗組子實體不同溶劑萃取物,對肝癌細胞的細胞抑制率------68
圖9-3 S廠商不同溶劑萃取物,對肝癌細胞的細胞抑制率-----------------69
圖9-4 靈芝不同溶劑萃取物,對肝癌細胞的細胞抑制率------------------69
表1-1 牛樟芝一般成分分析-----------------------------------------------------15
表1-2 牛樟芝微量金屬含量分析-----------------------------------------------16
表1-3 牛樟芝胺基酸組成分析--------------------------------------------------17
表4-1 A、B、C、D四組再生菌絲外觀、刺激物和積分面積比較圖---------34
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林志遠 (2005) 牛樟芝子實體形成之探討。國立東華大學 生物技術研究所碩士論文。
吳嘉興 (2006) 助益菌對樟芝液態發酵多醣產率之影響。國立東華大學 生物技術研究所碩士論文。
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1. 牛樟芝子實體形成之探討
2. 牛樟芝子實體萃取物對於人類肝癌細胞株 HepG2之細胞凋亡機制探討
3. 牛樟芝子實體純化物antcin A在肝癌異種移植模型中誘導腫瘤細胞凋亡機制探討
4. 牛樟芝子實體萃取物誘導肺癌細胞進行細胞凋亡之研究
5. 牛樟芝子實體活性成分抑制前列腺癌之作用機轉
6. 牛樟芝子實體萃取物對於人類大腸癌細胞株 caco-2之細胞凋亡機制探討
7. 椴木栽培牛樟芝子實體之活性成分齒孔酸(三萜類)誘導人類肝癌細胞內質網壓力調節之自體吞噬
8. 椴木栽培牛樟芝子實體中三萜類活性成分 Antcin K藉由誘導人類肝癌細胞粒線體及內質網壓力調節之細胞凋亡達到抑癌效果
9. 特定牛樟芝子實體純化物對人類胃癌細胞株 AGS 之細胞凋亡機制探討
10. 牛樟芝子實體粗萃取及純化物抑制人類食道癌細胞株之研究
11. 特定牛樟芝子實體純化物對人類卵巢癌細胞株PA-1、OVCAR-3之影響
12. 人工段木培養之牛樟芝子實體萃取物對半乳糖胺誘發大鼠 急性肝損傷之保護作用
13. 特定牛樟芝子實體純化物對人類前列腺癌細胞在動物實驗內之細胞凋亡機制探討
14. 一.高通量篩選出牛樟芝菌絲體抗肝癌先導藥物化合物二.以p53、bax、bcl-2之m-RNA層次進行抗肝癌先導藥物化合物對人類肝癌細胞株HepG2凋亡途徑之探討
15. 牛樟芝輔助肝癌化學治療與改善抗藥性表現之藥理活性暨分子機制探討