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研究生:林馨怡
研究生(外文):Hsin-Yi Lin
論文名稱:樟芝液態培養應用於抗老化化妝品之研究
論文名稱(外文):The study of submerged culture of Antrodia camphorata for antiaging cosmetics
指導教授:楊芳鏘楊芳鏘引用關係盧錫祺盧錫祺引用關係
指導教授(外文):Fan-Chiang YangHsi-Chi Lu
學位類別:碩士
校院名稱:東海大學
系所名稱:化學工程學系
學門:工程學門
學類:化學工程學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2008
畢業學年度:96
語文別:中文
論文頁數:79
中文關鍵詞:樟芝基質金屬蛋白酶明膠電泳酵素分析法抗氧化抗老化
外文關鍵詞:Antrodia camphoratematrix metalloproteinaseMMPsantiaginggelatin zymographyantioxidant activity
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樟芝(Antrodia camphorata)是台灣特有的一種藥用菇類,已知主要的有效成份為多醣體以及三帖類,其生理活性成份及功能仍是目前研究重點。本研究中,我們期望利用樟芝多醣體具有抗氧化、清除自由基等功能,開發出新的抗老化產品。研究方法是以深層培養方式得到大量發酵液及樟芝菌絲體,取其胞外多醣體及菌絲萃取物,應用於抑制3T3小鼠纖維母細胞分泌之基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases, MMPs),並藉由Gelatin zymography分析MMP-2及MMP-9的活性。結果發現:樟芝胞外多醣體在濃度3.5 mg/ml的劑量下,處理3T3纖維母細胞培養液,可達到良好抑制MMP-2及MMP-9活性的效果,且具有還原力及DPPH自由基捕捉能力;而在菌絲體萃取物部份,以甲醇、乙醇及純水為溶劑,進行微波萃取,發現這三種萃取物對3T3細胞培養液內MMPs有明顯的抑制效果,其中以純水為溶劑之菌絲體微波萃取物抑制效果最為良好,對MMP-2及MMP-9之抑制率分別為60%及82%,且在抗氧化部份,其還原力及DPPH自由基捕捉率與化學合成之抗氧化劑BHA非常接近,顯示具有非常強之抗氧化性。因此綜合以上研究結果,我們認為樟芝之胞外多醣體及菌絲體萃取物,在抗老化化妝品的有效成份應用上,的確具有開發潛力。
Antrodia camphorata is an endemic medical mushroom in Taiwan. It is well known that the major effective components in this medical fungus are polysaccharides and triterpenoids. The bioactivity and efficacy of A. camphorate are still the main focus in many researches. The study expects to take the availability of antioxidant activity and DPPH radical scavenging activity for developing new antiaging cosmetics. The submerged culture of A. camphorate produced abundant fermentation broth and mycelium. The purpose of this study was to investigate the exopolysaccharides from broth and the extraction from mycelium in inhibiting the activities of matrix metalloproteinases(MMPs) secreted from 3T3 fibroblast. The analysis by gelatin zymography showed that exopolysaccharides at the concentration 3.5 mg/ml did inhibit the activities of MMP-2 and MMP-9. It also had well reducing power and DPPH redicals scavenging ability. The mycelium was extracted by microwave with the solvent of methanol, ethanol, and water. These three mycelium extracts all had obvious inhibition on MMP-2 and MMP-9, especially the water one. The mycelium extract by microwave with the solution of water had the inhibition 60% and 82% on MMP-2 and MMP-9. Besides, it had great antioxidant activity based on the reducing power determination and the DPPH radicals scavenging test. In conclusion, we suggest that exopolysaccharides and mycelium extracts from Antrodia camphorate do have the antiaging capacities and can be effective used in antiaging cosmetics.
中文摘要........................................................................................................... I
英文摘要..........................................................................................................II
目錄................................................................................................................ III
表目錄...........................................................................................................VII
圖目錄...........................................................................................................VII

第一章 緒論
1-1 緒論................................................................................................................1
1-2 生物性化妝品................................................................................................2
1-3 研究動機........................................................................................................2
第二章 文獻回顧
2-1 樟芝之介紹....................................................................................................4
2-1-1 樟芝之命名..........................................................................................4
2-1-2 樟芝之分類..........................................................................................4
2-1-3 樟芝之活性成份與生理功能..............................................................6
2-2 皮膚與老化....................................................................................................8
2-2-1 皮膚的構造..........................................................................................8
2-2-2 皮膚老化程序....................................................................................10
2-3 基質金屬蛋白酶與皮膚老化......................................................................12
2-3-1 基質金屬蛋白酶的種類與結構........................................................12
2-3-2 基質金屬蛋白酶與皮膚老化之關聯性............................................14
2-4 皮膚老化之自由基學說..............................................................................17
2-4-1 自由基................................................................................................18
2-4-2 活性氧................................................................................................18
2-4-3 脂質氧化反應....................................................................................19
2-4-4 抗氧化作用與機制............................................................................21
2-5實驗架構.......................................................................................................22
第三章 材料與方法
3-1 實驗菌株及細胞..........................................................................................23
3-2 實驗藥品......................................................................................................23
3-3 實驗儀器與設備..........................................................................................25
3-4 分析方法......................................................................................................26
3-5 實驗方法......................................................................................................31
3-5-1 樟芝菌種培養與保存........................................................................31
3-5-1-1 菌種斜面試管保存...................................................................31
3-5-1-2 培養皿平面培養與接菌活化...................................................31
3-5-1-3 種菌的製備...............................................................................31
3-5-2 三角瓶液態培養試驗........................................................................32
3-5-3 樟芝胞外多醣體濃度測定與製備....................................................32
3-5-4 樟芝菌絲體酵素萃取物之製備........................................................33
3-5-5 樟芝菌絲體微波萃取物之製備........................................................34
3-5-6 細胞培養與繼代................................................................................35
3-5-7 細胞存活率之測試 (WST-1 assay) ..................................................35
3-5-8 抑制MMP-2及MMP-9活性之測試 (Gelatin zymography)..........36
第四章 結果與討論
4-1 樟芝三角瓶液態培養試驗..........................................................................38
4-2 樟芝胞外多醣體之細胞效應......................................................................40
4-2-1 樟芝多醣體濃度對細胞存活率之影響............................................40
4-2-2 樟芝多醣體濃度對抑制MMP-2及MMP-9活性之影響.................42
4-2-3 樟芝多醣體處理細胞培養液反應時間對抑制MMP-2及MMP-9活性之影響.............................................................................................45
4-3 樟芝菌絲體酵素萃取物之細胞效應..........................................................48
4-3-1 樟芝菌絲體酵素萃取物對細胞存活率之影響................................48
4-3-2 樟芝菌絲體酵素萃取物對抑制MMP-2及MMP-9活性之影響.....50
4-4 樟芝菌絲體微波萃取物之細胞效應..........................................................53
4-4-1 樟芝菌絲體微波萃取物對細胞存活率之影響................................53
4-4-2 樟芝菌絲體微波萃取物對抑制MMP-2及MMP-9活性之影響.....55
4-5 MMP-2及MMP-9活性之直接抑制分析....................................................58
4-5-1 樟芝多醣體對MMP-2及MMP-9活性之直接抑制.........................58
4-5-2 樟芝菌絲體微波萃取物對MMP-2及MMP-9活性之直接抑制.....61
4-6 還原力之測定..............................................................................................64
4-6-1 樟芝胞外多醣體還原力之測定........................................................64
4-6-2 樟芝菌絲體萃取物還原力之測定....................................................66
4-7 捕捉DPPH自由基能力之測定...................................................................68
4-7-1 樟芝胞外多醣體對DPPH自由基捕捉率之測定.............................68
4-7-2 樟芝菌絲體萃取物對DPPH自由基捕捉率之測定.........................70
第五章 結論與未來展望
5-1 結論..............................................................................................................72
5-2 未來展望......................................................................................................74
參考文獻.............................................................................................................75



表目錄
表3-1各酵素之反應pH及溫度.........................................................................33
表3-2細胞培養基組成.......................................................................................35
圖目錄
圖2-1 樟芝固態平面培養...................................................................................5
圖 2-2 樟芝液態培養14天形成之菌絲球..........................................................5
圖2-3 皮膚表皮層的主要結構...........................................................................8
圖2-4 細胞各層的結構組成.............................................................................11
圖2-5 基質金屬蛋白酶(MMPs)之分類............................................................13
圖2-6 MMPs分解第一型膠原蛋白...................................................................15
圖2-7 基質金屬蛋白酶(MMPs)三級結構示意圖............................................16
圖 2-8 丙二醛之結構式....................................................................................20
圖4-1 時間對樟芝液態培養及多醣體生成之影響.........................................39
圖4-2 樟芝胞外多醣體濃度對細胞存活率之影響.........................................41
圖4-3樟芝胞外多醣體濃度對MMP-2及MMP-9活性之影響.......................43
圖4-4 樟芝胞外多醣體濃度對MMP-2及MMP-9活性抑制之影響..............44
圖4-5 樟芝胞外多醣體處理時間對MMP-2及MMP-9活性之影響..............46
圖4-6 樟芝胞外多醣體處理時間對MMP-2及MMP-9活性抑制之影響......47
圖4-7不同酵素分解菌絲體之萃取物對細胞存活率之影響...........................49
圖4-8 不同酵素分解菌絲體之萃取物對MMP-2及MMP-9活性之影響......51
圖4-9 不同酵素分解菌絲體之萃取物MMP-2及MMP-9活性抑制之影響..52
圖4-10 不同樟芝菌絲體微波萃取物對細胞存活率之影響...........................54
圖4-11 不同菌絲體微波萃取物對MMP-2及MMP-9活性之影響................56
圖4-12不同菌絲體微波萃取物對MMP-2及MMP-9活性抑制之影響.........57
圖4-13 樟芝胞外多醣體濃度對直接抑制細胞分泌MMP-2及MMP-9之影響...........................................................................................................59
圖4-14 樟芝胞外多醣體濃度對直接抑制細胞分泌MMP-2及MMP-9活性之影響...................................................................................................60
圖4-15 不同菌絲體微波萃取物對直接抑制細胞分泌MMP-2及MMP-9之影響.......................................................................................................62
圖4-16 不同菌絲體微波萃取物對直接抑制細胞分泌MMP-2及MMP-9活性之影響...............................................................................................63
圖4-17 樟芝多醣體濃度對還原力之影響.......................................................65
圖4-18 不同樟芝菌絲體萃取物對還原力之影響...........................................67
圖4-19 樟芝多醣體濃度對DPPH自由基捕捉率之影響................................69
圖4-20 樟芝菌絲體萃取物對DPPH自由基捕捉率之影響............................71
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