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臺灣博碩士論文加值系統

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研究生:王宣芸
研究生(外文):Hsuan-Yun Wang
論文名稱:含子實體特有三萜類的轉殖牛樟芝菌絲體之篩選與其大量培養系統之建立
論文名稱(外文):Analysis of Fruiting Bodies-Specific Triterpennoids in Activation-Tagged Antrodia cinnamomea and Establishment of Its Large-Scale Production System
指導教授:蔡新聲蔡新聲引用關係陳靖棻陳靖棻引用關係
指導教授(外文):Hsin-Sheng TsayChin-Fun Chen
學位類別:碩士
校院名稱:朝陽科技大學
系所名稱:生化科技研究所碩士班
學門:生命科學學門
學類:生物科技學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2011
畢業學年度:99
語文別:中文
論文頁數:78
中文關鍵詞:三萜類大量培養牛樟芝麥角甾烷
外文關鍵詞:Antrodia cinnamomeaergostanelarge-ScaleTriterpennoids
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牛樟芝(Antrodia cinnamomea)為台灣知名傳統中藥藥用真菌,常用於治療癌症、高血糖、抗氧化、抗發炎等。牛樟芝所含具有抗癌、抗發炎等之三萜大多存於其子實體中,然而子實體的取得又十分不易。由於本研究室已成功利用主動誘變方法得到含較高抗發炎三萜類dehydroeburicoic acid and dehydrosulpurenic acid之牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2,故本試驗試圖從前述主動誘變轉殖牛樟芝菌絲體中,尋找含於牛樟芝子實體中抗發炎(antcin A)、抗副交感神經作用(antcin B)以及抗膽鹼(antcin C)之三萜類之菌絲體。首先,使用牛樟芝子實體進行分層萃取(partition)以取得antcin A、B及C標準品,接著將3個轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2品系進行萃取並分析,結果顯示在三個轉殖系牛樟芝菌絲體中皆可測得antcin A、B、C成分,其中轉殖系在antcin A的含量比未轉殖牛樟芝菌絲體高3-40倍,antcin B則更多出20-60倍,另外轉殖系H所含之antcin A、B及C成分較其它轉殖系高。由於轉殖系牛樟芝菌絲體含有子實體特有之成份,因此更進一步建立牛樟芝轉殖系菌絲體的量產條件有其必要,為此,本研究利用紗布、牙籤等輔助材料當作培養之基質進行培養,其中由於以牙籤培養之菌絲生長較豐厚飽滿,因此選用為最佳培養之基質材料。經HPLC分析後,發現轉殖牛樟芝菌絲體大量培養後所含的antcin A和B分別是未轉殖牛樟芝菌絲體的1-1.7倍以及1.7倍,而dehydrosulphurenic acid 及dehydroeburicoic acid則是2-3.5倍及5-16倍。此結果明顯比小量培養差,故利用牙籤大量培養之建立無助於量產前述含高量antcin A、B及C成份之轉殖牛樟芝菌絲體。最後,由於在H、J-1與J-2等3個轉殖牛樟芝菌絲體中可測得antcin A、B及C三萜生合成路徑上,重要酵素sterol 14α-demethylase之表現量較高,故推測有可能為主動誘變影響了相關三萜生合成相關基因之表現。
Antrodia cinnamomea, a medicinal fungi, is well known in Taiwan as source of traditional Chinese medicine for the treatment of cancer, hyperglycemia, anti-oxidation and anti-inflammation. Triterpenoids with anti-cancer or anti-inflammatory effect are mainly found in the rare and valuable fruiting bodies of A. cinnamomea. Therefore an activation-tagging method was established previously in our lab to obtain A. cinnamomea mycelia with enhanced anti-inflammatory t riterpenoids (dehydroeburicoic acid and dehydrosulphurenic acid). The activation-tagged mycelia H, J-1and J-2 are used in this study to verify possible content of fruiting bodies specific triterpenoids: antcin A (anti-inflammatory), antcin B (anti-parasympathetic) and antcin C (anticholinergic). In order to obtain antcin A, B and C standards, the fruiting bodies of A. cinnamomea were extracted through partition. On the other hand, selected transgenic lines H, J-1 and J-2 were treated with standard extraction. After HPLC analysis, the results showed that all transgenic lines contain antcin A, B, C (antcin A is 3-40 times higher than the wild type, antcin B is 20-60 fold), specially H line. Based on this result, a large scale production system was developed by using gauze, toothpicks and other supporting materials as the matrix for culture. Toothpick was proved to be the best one for mycelia growth and was then used for large scale production of H, J-I and J-2. After HPLC analysis, the result showed that antcin A and B in transgenic lines H, J-1 and J-2 are 7-17.2 times and 3-7 times higher than wild-type respectively after large scale production, and dehydrosulphurenic acid and dehydroeburicoic acid are 2-3.5 times and 5-16 times higher than wild-type. Compared to the previous data, the toothpick-based large scale production system is not ideal one for the production of transgenic lines. And as sterol 14α-demethylase, key enzyme of triterpenoid biosynthesis, was detected with higher expression in all three transgenic lines, this may indicate a possible activation-tagged insertion altered the expression of genes involved in triterpenoid biosysthesis.
目錄
口試委員會審定書 #
中文摘要 I
英文摘要 III
誌謝 V
目錄 VI
表目錄 IX
圖目錄 X
附錄目錄 XII
壹、前言 1
貳、文獻回顧 2
一、牛樟芝簡介 2
(一)牛樟芝分類 2
(二)牛樟芝型態. 3
(三)牛樟芝分佈. 4
(四)牛樟芝活性成分. 5
(五)牛樟芝子實體與菌絲體成分差異 6
(六)牛樟芝藥理應用 8
(七)牛樟芝萃取方法 12
二、萜類生合成路徑與轉殖牛樟芝菌絲體 13
(一)萜類之介紹 13
(二) 三萜類合成機制與主動誘變轉殖牛樟芝菌絲體. 15
三、牛樟芝放大培養. 19
(一) 椴木(段木)栽培. 19
(二)液態深層發酵 19
(三)固態培養. 20
参、材料方法. 22
一、試驗材料. 22
(一) 牛樟芝菌種來源與保存方法. 22
二、試驗方法. 22
(一) 牛樟芝菌絲體之大量附著培養. 22
(二) 轉殖牛樟芝菌絲體之genomic DNA之萃取. 22
(三) 轉殖牛樟芝菌絲體之確認. 24
(四) 牛樟芝菌絲體之羊毛甾烷三萜類含量測定. 24
(五) 牛樟芝菌絲體之麥角甾烷三萜類含量測定. 25
(六) 三萜合成途徑中關鍵基因表現量分析. 27
肆、結果與討論 29
一、轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之繼代與其羊毛甾烷三萜類含量確認 29
(一) 轉殖牛樟芝轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之繼代 29
(二) 牛樟芝菌絲體之羊毛甾烷三萜類含量測定 29
二、子實體成分取得與轉殖牛樟芝成分分析 30
(一) 子實體活性成分純化與分離 31
(二) 轉殖牛樟芝菌絲體之麥角甾烷三萜類含量測定 32
三、轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之大量培養系統建立 33
(一) 牛樟芝菌絲體之大量附著培養 33
(二) 大量轉殖牛樟芝菌絲體之成分分析 34
四、轉殖牛樟芝菌絲體表現量分析 36
伍、結論與未來展望 38
陸、參考文獻 61
柒、附錄 68
表目錄
表1. 轉殖牛樟芝菌絲體之GUS與HPT基因與基因表現量引子之
一表覽 ............................................................................................... 39
表2. 羊毛甾烷三萜類標準品移動相沖提梯度之一覽表 ....................... 40
表3. 麥角甾烷三萜類標準品移動相沖提梯度之一覽表 ....................... 40
表4. 高效液相層析分析使用儀器之一覽表 ........................................... 40
表5. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之羊毛甾烷化合物含量之測
定 ....................................................................................................... 41
表6. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之麥角甾烷化合物含量之測
定 ..................................................................................................... 42
表7. 大量轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之羊毛甾烷化合物含量
之測定 ............................................................................................... 43
表8. 大量轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之麥角甾烷化合物含量
之測定 ............................................................................................... 44
圖目錄
圖 1. 轉殖牛樟芝菌絲體之固態培養 ...................................................... 45
圖 2. 利用PCR確認轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2中篩選及報導
基因之存在 ..................................................................................... 46
圖 3. 羊毛甾烷三萜類標準品高效液相層析分析圖譜及檢量線 .......... 47
圖 4. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之羊毛甾烷HPLC分析圖譜. 48
圖 5. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之羊毛甾烷HPLC含量分析
量化圖 ............................................................................................. 49
圖 6. 麥角甾烷三萜類標準品高效液相層析分析圖譜 .......................... 50
圖 7. 麥角甾烷三萜類標準品高效液相層析分析之三萜檢量線 .......... 51
圖 8. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之麥角甾烷HPLC分析圖譜. 52
圖 9. 轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之麥角甾烷HPLC含量分析
量化圖 ............................................................................................. 53
圖10. 牛樟芝菌絲體之小量液態附著培養 ............................................. 54
圖11. 牛樟芝菌絲體之water agar懸浮培養 .......................................... 55
圖12. 牛樟芝菌絲體之牙籤與紗布附著培養 ........................................ 56
圖13. 轉殖牛樟芝菌絲體大量固態牙籤附著培養 ................................ 57
圖14. 大量轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之羊毛甾烷HPLC含量
分析量化圖 ................................................................................... 58
圖15. 大量轉殖牛樟芝菌絲體H、J-1與J-2之麥角甾烷HPLC含量
分析量化圖 ..................................................................................... 59
圖16. Sterol 14-demethylase表現量之分析............................................ 60
陸、參考文獻

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QRCODE
 
 
 
 
 
                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
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