臺灣博碩士論文加值系統

Unpaired3 (Upd3)是果蠅Jak/STAT訊息傳遞鏈的配體，它參與幼蟲眼睛發育、生殖腺發育、淋巴腺發育(造血作用)及免疫反應。upd3基因在果蠅幼蟲期表達於眼碟、雄性生殖腺及成蟲睪丸中。當upd3基因發生缺失時，果蠅成蟲會產生小眼。在幼蟲時期，upd3基因參與血球細胞分化的調控，以維持血球細胞的恆定。當中腸細胞受傷或受革蘭氏陰性菌Erwinia carotovora carotovora 15 (Ecc15) 感染，會表達Upd3活化Jak/STAT訊息傳遞鏈，促進腸幹細胞增生及分化，以修補受損的腸細胞。當細胞在正確的時間和地點表達Jak/STAT訊息傳遞鏈配體Upd3，會活化Jak/STAT訊息傳遞鏈，進而調控果蠅眼睛、血球細胞發育及免疫反應。我的研究是探討果蠅發育過程中，upd3配體受到的轉錄調控，以了解upd3基因上游的調控機制。為尋找調控果蠅upd3基因的增強子位置，我分析upd3基因上下游共17.8Kb範圍，建構17組DNA片段(A-O2)，放入帶有綠色螢光蛋白(GFP)標記的增強子分析載體，利用顯微注射法將增強子分析載體放入果蠅中以篩選轉殖果蠅。我藉由觀察綠色螢光蛋白是否表達於轉殖果蠅中，以了解轉殖DNA片段是否具有調控upd3基因的增強子，並進一步了解可能調控upd3基因表現的上游訊息鏈。在我的實驗中，在upd3基因下游1.8Kb找到一個M片段(1.2Kb)的可能upd3增強子，它可能參與在幼蟲眼碟、中腸細胞中有表達。此外，我也觀察到M片段增強子也調控參與淋巴腺的幹細胞棲位—後端訊息中心(Posterior Signaling Center，PSC)、雄性幼蟲生殖腺及成蟲睪丸幹細胞棲位(Hub)的upd3表達。我進一步將這段1.2Kb的可能upd3增強子M片段，切割成M1和M2片段。M1片段可以表達出與M片段相似的模式。為了解upd3基因上游可能訊息鏈，我在建構的17.8Kb範圍內，分析可能調控訊息鏈的轉錄因子結合位，找到11個Suppressor of Hairless (Su(H))、13個STAT92E及15個AP-1結合位。在1.2KbM片段中，我找到2個Su(H)和2個STAT92E結合位。M片段可能受到Notch及Jak/STAT訊息傳遞鏈的調控。藉由upd3增強子研究，我發現一段最小可以反應upd3基因在雄性生殖腺及淋巴腺幹細胞棲位表達的0.8Kb片段。這段0.8 Kb幹細胞棲位增強子的發現，將有助於了解果蠅upd3基因參與在生殖腺和淋巴腺發育的研究。

Unpaired3 (Upd3) is a ligand of Janus Kinase/ Signal Transducers and Activators of Transcription (Jak/STAT) signaling in Drosophila. upd3 takes part in eye, gonad, haematopoiesis and immune response. upd3 is expressed in eye-antenna disc, gonad in the larval stages and testis in adult. The upd3 null mutant is fertile and viable with small eye. Upd3 regulates hemocyte differentiation to maintain homeostasis of hemolymph in the larval stages. upd3 is induced after septic injury or oral infection in midgut to maintain homeostasis of intestine in the larval stage. The appropriate regulation of ligands temporally and spatially is required to activate Jak/STAT signaling to control multiple developmental processes. In this study, I focus on the transcriptional regulation of the upd3 gene and further study the upstream signaling of the upd3 gene. I analyzed the upd3 enhancers in vivo. The 17.8Kb genomic regions around the upd3 gene, designed as 17 constructs, were analyzed. These upd3 genomic fragments were cloned to enhancer-testing vector, pH-Stinger, which contains a GFP reporter. The enhancer-testing constructs were injected into Drosophila and then selected for transgenic lines. The expression pattern of GFP reporter was examined in vivo. I found a possible 1.2Kb upd3 enhancer, M fragment. M fragment locates at 1.8Kb downstream of the upd3 gene. It may regulate eye, intestine cells, posterior signaling center (PSC) in lymph gland and hub in testis. I narrowed down this enhancer fragment and found a smaller fragment, M1, which can express the upd3 gene in the stem cell niche of gonad and lymph gland in Drosophila. To understand the upstream signaling of the upd3 gene, I predicted the possible transcriptional factor binding sites. I found multiple Suppressor of Hairless (Su(H)), STAT92E and AP-1 binding sites in 17.8Kb genomic regions of the upd3 gene. There are two Su(H) and two STAT92E binding sites in the possible 0.8Kb upd3 enhancer fragment (M1 fragment). The M1 fragment may regulate upd3 transcription through Notch signaling and Jak/STAT signaling. Based on my study, I found a minimal fragment can express the upd3 gene in the stem cell niche of gonad and lymph gland in Drosophila. The discovery of 0.8 Kb DNA fragment may help us to understand the roles of the upd3 gene in the male gonad and lymph gland development in Drosophila.

目錄･･･････････････････････････････････････････････････････････････1
中文摘要･･･････････････････････････････････････････････････････････5
英文摘要･･･････････････････････････････････････････････････････････7
前言･･･････････････････････････････････････････････････････････････9
‧ Jak/STAT訊息傳遞鏈･･･････････････････････････････････････9
‧ Jak/STAT訊息傳遞鏈調控果蠅生長發育及生理反應････････････10
‧ Upd3調控果蠅複眼發育･････････････････････････････････････11
‧ Upd3調控果蠅中腸受傷或受細胞感染的恆定･･･････････････････12
‧ Upd3調控果蠅淋巴腺發育･･･････････････････････････････････13
‧ Upd3調控雄性果蠅生殖腺發育･･･････････････････････････････14
‧ 增強子分析載體—pH-Stinger･･････････････････････････････16
 實驗材料･････････････････････････････････････････････････18
‧ 果蠅株････････････････････････････････････････････････････18
‧ 引子･･････････････････････････････････････････････････････18
‧ 化學藥品･･････････････････････････････････････････････････21
‧ 組織染色抗體･･････････････････････････････････････････････23
 實驗方法･･････････････････････････････････････････････････25
‧ 果蠅genomic DNA製備･･････････････････････････････････････25
‧ 聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR) ･･････26
‧ DNA純化 (Gel elution)･･･････････････････････････････････26
‧ 轉型作用 (Transformation)･･･････････････････････････････27
‧ 小量質體DNA製備･･･････････････････････････････････････････29
‧ 質體DNA序列分析･･･････････････････････････････････････････29
‧ 中量質體DNA製備･･･････････････････････････････････････････29
‧ 建立轉殖果蠅株 (Transgenic fly line)････････････････････31
‧ 免疫螢光染色法････････････････････････････････････････････32
‧ 革蘭氏陰性菌Ecc15感染果蠅幼蟲中腸･････････････････････････32
 實驗結果･･････････････････････････････････････････････････34
‧ upd3-GAL4和NP6099-GAL4在活體中的表現模式････････････････34
‧ upd3 增強子分析範圍･･･････････････････････････････････････36
‧ 調控果蠅生殖腺幹細胞棲位之upd3 增強子分析･････････････････37
‧ 調控果蠅淋巴腺幹細胞棲位之upd3 增強子分析･････････････････38
‧ 調控果蠅在中腸受傷或受細菌感染後，維持中腸細胞恆定之upd3 增強子分析･･･････････････････････････････････････････････････････････････････38
‧ 調控果蠅複眼發育之upd3 增強子分析･･････････････････････････39
‧ M1片段反應M片段在生殖腺及淋巴腺幹細胞棲位模式･･････････････40
‧ 反應果蠅株upd3>GFP的upd3增強子分析････････････････････････41
‧ 反應果蠅株NP6099>GFP的upd3增強子分析･･････････････････････41
‧ Notch及Jak/STAT訊息傳遞鏈可能為upd3基因上游訊息鏈･････････42
‧ upd3基因座中M片段在演化上的保留度･･････････････････････････43
‧ upd3基因座中I片段在演化上的保留度･･････････････････････････44
‧ 在upd2和upd3基因缺失下，不影響M片段在雄性幼蟲生殖腺及淋巴腺幹細胞棲位的表達･･･････････････････････････････････････････････････････････････45
 實驗討論････････････････････････････････････････････････････47
‧ upd3基因可能參與生殖腺幹細胞棲位及淋巴腺幹細胞棲位調控･･････47
‧ upd3基因影響雄性生殖能力････････････････････････････････････47
‧ M1片段可以反應M片段的upd3增強子表達･････････････････････････49
‧ M及M1片段可能受到Notch和Jak/STAT訊息傳遞鏈的調控，表達在生殖腺及淋巴腺幹細胞棲位･･････････････････････････････････････････････････････････49
‧ E0F片段可以反應果蠅株upd3>GFP在幼蟲淋巴腺的表達･････････････50
‧ 調控果蠅株upd3>GFP在中腸受傷或受細菌感染後表現綠色螢光蛋白的upd3增強子，可能位於E和E0F片段中･･････････････････････････････････････････････50
‧ 調控眼碟神經膠細胞的upd3增強子，可能需要透過不同DNA片段上的轉錄因子一起調控･･････････････････････････････････････････････････････････････････････51
‧ Notch訊息傳遞鏈可能調控upd3基因表達在淋巴腺幹細胞棲位････････51
‧ M片段中表達在淋巴腺PSC可能透過轉錄因子Srp和Su(H)･････････････52
‧ 在upd2和upd3基因缺失下，M片段活體表現不受影響的可能原因･･････････････････････････････････････････････････････････････････････53
參考文獻 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････55
圖表目錄････････････････････････････････････････････････････････････････60
圖表 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････62
附圖 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････････86
個人資料 ･･･････････････････････････････････････････････････････････････89



圖表目錄
表目
‧ 表一、upd3 DNA片段接入載體的限制內切酶位點及片段大小･････62
‧ 表二、製備轉殖果蠅之DNA片段接入pH-Stinger之方向、取得獨立轉殖果蠅株數及已分析的獨立轉殖果蠅株･･･････････････････････････････････････････63
‧ 表三、upd3增強子片段之活體綠色螢光蛋白分析結果････････････64
‧ 表四、upd、upd2、upd3表現模式的比較･･････････････････････66
圖目
‧ 圖一、upd3基因增強子分析･･･････････････････････････････････69
‧ 圖二、upd3增強子在雄性幼蟲生殖腺的作用･････････････････････71
‧ 圖三、 upd3增強子在雄性成蟲睪丸的作用･･････････････････････72
‧ 圖四、upd3增強子在幼蟲淋巴腺的作用･････････････････････････74
‧ 圖五、upd3增強子在幼蟲中腸受革蘭氏陰性菌Ecc15感染的作用･･･75
‧ 圖六、upd3增強子在幼蟲眼碟的作用･･･････････････････････････77
‧ 圖七、分析upd3基因的可能上游訊息鏈 ････････････････････････78
‧ 圖八、upd3增強子M片段的分析････････････････････････････････79
‧ 圖九、增強子M1片段可以反應upd3基因在幼蟲生殖腺及淋巴腺的作用･･･････････････････････････････････････････････････････････････････80
‧ 圖十、M片段在12個果蠅物種的演化保留度比對･･･････････････････81
‧ 圖十一、I片段在12個果蠅物種的演化保留度比對･････････････････83
‧ 圖十二、在upd2和upd3基因缺失下，不影響M片段在雄性幼蟲生殖腺和淋巴腺幹細胞棲位的表達･･･････････････････････････････････････････････････････85
附圖表
‧ 附圖一、果蠅的Jak/STAT 訊息傳遞鏈･･････････････････････････86
‧ 附圖二、upd3在幼蟲眼碟的表現的時間及位置････････････････････87
‧ 附圖三、upd3表現在雄性果蠅胚胎生殖腺及成蟲睪丸･･････････････88

Agaisse, H., Petersen, U.M., Boutros, M., Mathey-Prevot, B., and Perrimon, N. (2003). Signaling role of hemocytes in Drosophila JAK/STAT-dependent response to septic injury. Dev Cell 5, 441-450.
Arbouzova, N.I., and Zeidler, M.P. (2006). JAK/STAT signalling in Drosophila: insights into conserved regulatory and cellular functions. Development 133, 2605-2616.
Bailey, A.M., and Posakony, J.W. (1995). Suppressor of hairless directly activates transcription of enhancer of split complex genes in response to Notch receptor activity. Genes Dev 9, 2609-2622.
Barolo, S., Carver, L.A., and Posakony, J.W. (2000). GFP and beta-galactosidase transformation vectors for promoter/enhancer analysis in Drosophila. Biotechniques 29, 726, 728, 730, 732.
Buchon, N., Broderick, N.A., Chakrabarti, S., and Lemaitre, B. (2009). Invasive and indigenous microbiota impact intestinal stem cell activity through multiple pathways in Drosophila. Genes Dev 23, 2333-2344.
Crozatier, M., and Meister, M. (2007). Drosophila haematopoiesis. Cell Microbiol 9, 1117-1126.
Crozatier, M., Ubeda, J.M., Vincent, A., and Meister, M. (2004). Cellular immune response to parasitization in Drosophila requires the EBF orthologue collier. PLoS Biol 2, E196.
Gilbert, M.M., Weaver, B.K., Gergen, J.P., and Reich, N.C. (2005). A novel functional activator of the Drosophila JAK/STAT pathway, unpaired2, is revealed by an in vivo reporter of pathway activation. Mech Dev 122, 939-948.
Harrison, D.A., McCoon, P.E., Binari, R., Gilman, M., and Perrimon, N. (1998). Drosophila unpaired encodes a secreted protein that activates the JAK signaling pathway. Genes Dev 12, 3252-3263.Hartenstein, V., Takashima, S., and Adams, K.L. (2010). Conserved genetic pathways controlling the development of the diffuse endocrine system in vertebrates and Drosophila. Gen Comp Endocrinol 166, 462-469.
Heinemeyer, T., Wingender, E., Reuter, I., Hermjakob, H., Kel, A. E., Kel, O. V., Ignatieva, E. V., Ananko, E. A., Podkolodnaya, O. A., Kolpakov, F. A., Podkolodny N. L. and Kolchanov, N. A. (1998). Databases on Transcriptional Regulation: TRANSFAC, TRRD, and COMPEL. Nucleic Acids Res. 26, 364-370.
Hombria, J.C., and Brown, S. (2002). The fertile field of Drosophila Jak/STAT signalling. Curr Biol 12, R569-575.
Hombria, J.C., Brown, S., Hader, S., and Zeidler, M.P. (2005). Characterisation of Upd2, a Drosophila JAK/STAT pathway ligand. Dev Biol 288, 420-433.
Huang, Y.T. (2009). Study of the role of unpaired3 in Drosophila eye development. Tung-Hai Univ., M.S. Thesis.
Johansen, K.A., Green, R.B., Iwaki, D.D., Hernandez, J.B., and Lengyel, J.A. (2003). The Drm-Bowl-Lin relief-of-repression hierarchy controls fore- and hindgut patterning and morphogenesis. Mech Dev. 120, 1139-1151.
Jung, S.H., Evans, C.J., Uemura, C., and Banerjee, U. (2005). The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development 132, 2521-2533.
Kent, W.J. (2002). BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Res 12, 656-664.
Kisseleva, T., Bhattacharya, S., Braunstein, J., and Schindler, C.W. (2002). Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 285, 1-24.
Krzemien, J., Dubois, L., Makki, R., Meister, M., Vincent, A., and Crozatier, M. (2007). Control of blood cell homeostasis in Drosophila larvae by the posterior signalling centre. Nature 446, 325-328.
Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., and Banerjee, U. (2000). Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science 288, 146-149.
Lebestky, T., Jung, S.H., and Banerjee, U. (2003). A Serrate-expressing signaling center controls Drosophila hematopoiesis. Genes Dev 17, 348-353.
Lecourtois, M., and Schweisguth, F. (1995). The neurogenic suppressor of hairless DNA-binding protein mediates the transcriptional activation of the enhancer of split complex genes triggered by Notch signaling. Genes Dev 9, 2598-2608.
Lin, H. (2002). The stem-cell niche theory: lessons from flies. Nat Rev Genet 3, 931-940.
Liu, Y.H. (2005). Study of the transcriptional regulation of unpaired expression in Drosophila eye development. Yang-Ming Univ., M.S. Thesis.
Luo, H., and Dearolf, C.R. (2001). The JAK/STAT pathway and Drosophila development. Bioessays 23, 1138-1147.
Luo, H., Rose, P., Barber, D., Hanratty, W.P., Lee, S., Roberts, T.M., D'Andrea, A.D., and Dearolf, C.R. (1997). Mutation in the Jak kinase JH2 domain hyperactivates Drosophila and mammalian Jak-Stat pathways. Mol Cell Biol 17, 1562-1571.
Mandal, L., Banerjee, U., and Hartenstein, V. (2004). Evidence for a fruit fly hemangioblast and similarities between lymph-gland hematopoiesis in fruit fly and mammal aorta-gonadal-mesonephros mesoderm. Nat Genet 36, 1019-1023.
Mandal, L., Martinez-Agosto, J.A., Evans, C.J., Hartenstein, V., and Banerjee, U. (2007). A Hedgehog- and Antennapedia-dependent niche maintains Drosophila haematopoietic precursors. Nature 446, 320-324.
Micchelli, C.A., and Perrimon, N. (2006). Evidence that stem cells reside in the adult Drosophila midgut epithelium. Nature 439, 475-479.
Nellesen, D.T., Lai, E.C., and Posakony, J.W. (1999). Discrete enhancer elements mediate selective responsiveness of enhancer of split complex genes to common transcriptional activators. Dev Biol 213, 33-53.
Ohlstein, B., and Spradling, A. (2007). Multipotent Drosophila intestinal stem cells speci fy daughter cell fates by differential notch signaling. Science 315, 988-992.
Ready, D.F., Hanson, T.E., and Benzer, S. (1976). Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol 53, 217-240.
Tsai, Y.C., and Sun, Y.H. (2004). Long-range effect of upd, a ligand for Jak/STAT pathway, on cell cycle in Drosophila eye development. Genesis 39, 141-153.
Tokusumi, Y., Tokusumi, T., Stoller-Conrad, J., and Schulz, R.A. (2010) Serpent, suppressor of hairless and U-shaped are crucial regulators of hedgehog niche expression and prohemocyte maintenance during Drosophila larval hematopoiesis. Development 137, 3561-3568.
Tulina, N., and Matunis, E. (2001). Control of stem cell self-renewal in Drosophila spermatogenesis by JAK-STAT signaling. Science 294, 2546-2549.
Wang, C.J. (2007). Study of the transcriptional regulation of unpaired expression in Drosophila eye development. Yang-Ming Univ., M.S. Thesis.
Wang, L.H., Chiu, S.J., and Sun, Y.H. (2008). Temporal switching of regulation and function of eye gone (eyg) in Drosophila eye development. Dev Biol 321, 515-527.
Wawersik, M., Milutinovich, A., Casper, A.L., Matunis, E., Williams, B., and Van Doren, M. (2005). Somatic control of germline sexual development is mediated by the JAK/STAT pathway. Nature 436, 563-567.
Yamashita, Y.M., Fuller, M.T., and Jones, D.L. (2005). Signaling in stem cell niches: lessons from the Drosophila germline. J Cell Sci 118, 665-672.