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研究生:張文馨
研究生(外文):Wen-Hsin Chang
論文名稱:DNA水凝膠微膠囊結合序列置換放大法用於偵測miR-141
論文名稱(外文):DNA-based Hydrogel Microcapsules Coupled with Strand-Displacement Amplification for the Detection of miR-141
指導教授:廖韋晴
指導教授(外文):Wei-Ching Liao
學位類別:碩士
校院名稱:國立陽明大學
系所名稱:生化暨分子生物研究所
學門:生命科學學門
學類:生物化學學類
論文種類:學術論文
論文出版年:2019
畢業學年度:107
語文別:中文
論文頁數:77
中文關鍵詞:DNA水凝膠微膠囊miR-141雜交鏈鎖反應鏈置換放大反應
外文關鍵詞:DNA hydrogel microcapsulemiR-141hybridization chain reactionstrand displacement amplification
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目錄
致謝 I
中文摘要 II
英文摘要 III
目錄 IV
圖目錄 VII
表目錄 IX
一、 前言 1
1.1 研究動機 1
1.2 前列腺癌的生物標記物 (biomarker) 2
1.3 miR-141 4
1.4 偵測miRNA之方法 5
二、 實驗材料與方法 7
2.1 藥品試劑 7
2.2 實驗儀器 10
三、 階段一:設計、合成及鑑定DNA水凝膠微膠囊 11
3.1 前言 11
3.1.1 去氧核醣核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 水凝膠 (hydrogel) 微膠囊 11
3.1.2 雜交鏈鎖反應 (Hybridization Chain Reaction, HCR) 12
3.1.3 DNA水凝膠微膠囊設計構想 13
3.2 實驗材料與方法 15
3.2.1 去氧核醣核酸 (DNA) 序列 15
3.2.2 合成DNA 共軛聚合物 15
3.2.2 合成聚丙烯酸 (poly (acrylic acid), PAA) 修飾的promoter 16
3.2.3 量子點移相 16
3.2.4 合成包裹Tetramethylrhodamine-modified dextran (TMR-D) /量子點 (Quantum dot, QD) 碳酸鈣顆粒 16
3.2.5 合成DNA水凝膠修飾碳酸鈣顆粒 17
3.2.6 形成DNA水凝膠微膠囊 17
3.2.7 共軛焦雷射螢光顯微鏡 (Confocal Laser Fluorescence Microscope, CLFM/CLSM) 鑑定DNA水凝膠微膠囊 18
3.2.8 掃瞄式電子顯微鏡 (Scanning Electron Microscope, SEM) 鑑定DNA水凝膠微膠囊 18
3.2.9 能量散佈分析儀 (Energy Dispersive Spectrometer, EDS) 鑑定DNA水凝膠微膠囊 19
3.2.10 丙烯醯胺與丙烯酸基團修飾的核酸分子結合比例的測定 19
3.3 實驗結果與討論 20
3.3.1 DNA水凝膠微膠囊的鑑定-共軛焦雷射螢光顯微鏡 20
3.3.1.1 鑑定裝載TMR-D的DNA水凝膠微膠囊 20
3.2.1.2 鑑定裝載QDs的DNA水凝膠微膠囊 23
3.3.2 DNA水凝膠微膠囊的鑑定-掃瞄式電子顯微鏡 29
3.3.3 DNA水凝膠微膠囊的鑑定-能量散佈分析儀 30
3.3.4 丙烯醯胺與丙烯酸基團修飾的核酸分子結合比例的測定 31
3.4 結論 32
四、階段二:核酸觸發微膠囊釋放測試 33
4.1 前言 33
4.1.1 序列置換反應 (Strand Displacement Reaction, SDR) 33
4.1.2 微膠囊釋放機制 34
4.2 實驗材料與方法 35
4.2.1 去氧核醣核酸 (DNA) 序列 35
4.2.2 序列選擇性測試 35
4.2.3 不同作用時間對於釋放之測試 35
4.2.4 不同miR-141濃度對於微膠囊釋放之測試 35
4.2.5 螢光光譜儀測試微膠囊釋放之螢光強度 36
4.2.6 基質效應測試 36
4.3 實驗結果與討論 37
4.3.1 裝載TMR-D DNA水凝膠微膠囊釋放測試 37
4.3.2 裝載QDs DNA水凝膠微膠囊合成條件最佳化 38
4.3.3 裝載QDs DNA水凝膠微膠囊釋放測試 40
4.3.3.1 序列選擇性測試 40
4.3.3.2 不同作用時間對於釋放之測試 41
4.3.3.3 不同miR-141濃度對於微膠囊釋放之測試 42
4.3.4 基質效應測試 43
4.3.5 微膠囊一致性測試 44
4.3.4.1 同批合成不同天測試 (day to day) 44
4.3.4.2 不同批同條件測試 (batch to batch) 45
4.4 結論 46
五、階段三:目標偵測物訊號放大策略 48
5.1 前言 48
方法一: 置換序列放大反應 48
5.2 實驗材料與方法 49
5.2.1 去氧核醣核酸 (DNA) 序列 49
5.2.2 序列置換作用效率之測試 49
5.3 實驗結果與討論 50
5.4 結論 51
方法二: 酵素協助序列置換放大法 52
5.5 實驗材料與方法 54
5.5.1 去氧核醣核酸 (DNA) 序列 54
5.5.2 序列雜交測試 54
5.5.3 酵素協助序列置換放大測試 54
5.5.4 酵素協助序列置換放大結合DNA水凝膠微膠囊 55
5.5.5 基質效應測試 55
5.6 實驗結果與討論 56
5.6.1 序列雜交測試 56
5.6.2 Auxiliary Strand (AS) 與New Auxiliary Strand (NAS) 放大效率測試 58
5.6.3 Auxiliary Strand Hairpin (ASHP) 放大效率測試 59
5.6.3.1 酵素比例放大效率測試 59
5.6.3.2 反應時間放大效率測試 61
5.6.3.3 酵素濃度最佳化放大測試 63
5.6.3.4 不同濃度miR-141放大測試 65
5.6.4 酵素協助序列置換放大法結合DNA水凝膠微膠囊 66
5.6.5 基質效應測試 67
5.7 結論 68
六、 結論與未來展望 69
七、 參考文獻 71
附錄一 去氧核醣核酸 (DNA) 序列 77 
圖目錄
圖 1 miR-141在前列腺癌細胞中的調節途徑。 4
圖 2 雜交鏈鎖反應 (HCR) 示意圖。 12
圖 3 DNA水凝膠微膠囊結構及合成示意圖。 14
圖 4 共軛焦雷射螢光顯微鏡 (CLSM) 觀察裝載TMR-D碳酸鈣顆粒的影像。 21
圖 5 共軛焦雷射螢光顯微鏡 (CLSM) 觀察DNA水凝膠修飾裝載TMR-D碳酸鈣顆粒的影像。 22
圖 6 共軛焦雷射螢光顯微鏡 (CLSM) 觀察裝載QDs的碳酸鈣顆粒的影像。 25
圖 7 共軛焦雷射螢光顯微鏡觀察 poly (acrylamine hydrochloride) (PAH) 修飾裝載QDs的碳酸鈣顆粒的影像。 26
圖 8 共軛焦雷射螢光顯微鏡觀察PAH及poly (acrylic acid) (PAA)-promoter修飾的裝載QDs的碳酸鈣顆粒的影像: 27
圖 9 共軛焦雷射螢光顯微鏡觀察DNA水凝膠修飾裝載QDs的碳酸鈣顆粒及DNA水凝膠微膠囊的影像。 28
圖 10 利用SEM觀察 (A) 包裹QDs的碳酸鈣顆粒、 (B) 修飾DNA水凝膠修包裹QDs的碳酸鈣顆粒及 (C) 裝載QDs的DNA水凝膠微膠囊。 29
圖 11 (A)包裹QDs碳酸鈣顆粒的SEM影像,圈選處為EDS偵測位置; (B) EDS分析結果; (C) DNA水凝膠修飾的包裹QDs碳酸鈣顆粒的SEM影像,圈選處為EDS偵測位置; (D) EDS分析結果。 30
圖 12 H1共軛聚合物上核酸單元和丙烯醯胺單體單元之間的比例。 31
圖 13 H2H共軛聚合物上核酸單元和丙烯醯胺單體單元之間的比例。 31
圖 14 序列置換反應 (SDR) 示意圖。 33
圖 15 微膠囊釋放螢光訊號機制示意圖。 34
圖 16 裝載TMR-D DNA水凝膠微膠囊不同濃度miR-DNA的釋放結果。 37
圖 17 合成裝載QDs DNA水凝膠微膠囊條件最佳化。 39
圖 18 微膠囊序列專一選擇性測試結果。 40
圖 19 相同濃度的miR-141與微膠囊不同作用時間的測試。 41
圖 20 不同miR-141濃度對於微膠囊釋放之測試。 42
圖 21 基質效應測試。 43
圖 22 同批合成不同天測試結果 (day to day)。 44
圖 23 不同批微膠囊相同條件測試結果 (batch to batch)。 45
圖 24 置換序列和miR-141在微膠囊中作用示意圖。 48
圖 25 不同作用條件測試序列置換的最佳條件。 50
圖 26 酵素協助序列置換放大反應過程及產物與微膠囊作用之示意圖。 53
圖 27 Nt.BbvcI及Bst DNA polymerase 作用機制示意圖。 53
圖 28 序列雜交測試。 57
圖 29 使用miR-141、Amplifier-Hairpin (HP) 、Auxiliary Strand (AS) /New Auxiliary Strand (NAS) 測試酵素協助序列置換放大的結果。 58
圖 30 酵素比例放大測試結果。 60
圖 31 反應時間放大效率測試結果。 62
圖 32 酵素濃度放大效率測試結果。 63
圖 33 酵素濃度放大效率測試結果。 64
圖 34 不同濃度miR-141放大測試結果。 65
圖 35 酵素協助序列置換放大法結合DNA水凝膠微膠囊釋放之測試。 66
圖 36 基質效應測試。 67


表目錄
表 1 DNA水凝膠微膠囊之相關核酸序列 15
表 2 序列選擇性實驗相關序列。 35
表 3 置換序列放大反應相關序列。 49
表 4 酵素協助序列置換放大法相關序列。 54
表 5 miRNA偵測系統之文獻比較 70
表 6 DNA水凝膠微膠囊及放大策略之相關核酸序列 77
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