臺灣博碩士論文加值系統

木糖醇 ( xylitol ) 為一種五碳醇糖，無論甜度、甜味皆與蔗糖相似，並能有效預防齵齒發生、並能成為糖尿病患者之甜味劑，是一種具有高經濟價值的醇糖類。以往生產木糖醇所使用的原料是純木糖，但木糖成本高，故如何開發低成本的替代原料，又能保有合適的木糖醇產率是值得進行的研究工作。本研究利用水果當營養源自土壤分離純化出酵母菌，其中一分離菌株醱酵木糖產出木糖醇能力較高，經比對其 26S rDNA 核酸序列，鑑定為 Pichia caribbica，並與由國內食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心 ( BCRC ) 收集到的菌株 Candida guilliermondii ( BCRC 21326 ) 比較醱酵含木糖培養基產出木糖醇之適合條件。結果發現 P. caribbicai 與 C. guilliermondii 醱酵產出木糖醇之合適溫度分別為 35℃ 與 30℃ 。在培養基中添加葡萄糖能使 P. caribbica 醱酵木糖產出木糖醇的量增加1.5倍，但對於 C. guilliermondii 醱酵木糖產出木糖醇的量並無明顯增加；當木糖濃度 10% - 15% 時，兩株菌皆能有較佳之木糖醇產率。P. caribbica 與 C. guilliermondii 於轉速分別為50 - 100 rpm 與 100 - 150 rpm 時有較好的木糖醇產率。菌液接種於液體培養基之比例 ( v:v ) 由 1% 增加至 3% 時， C. guilliermondii 與 P. caribbica 的產率可增加 0.09 g g-1 ，此結果顯示，適當增加接種菌液的比例對於菌體有效利用木糖產出木糖醇有正面的幫助。
為降低木糖醇的生產成本，本研究收集十二種農業有機廢棄物，經過烘乾磨粉後，以 1.5% 硫酸水解，發現白玉米穗軸水解液中之木糖濃度最高為 2.45% 。用離子交換樹脂去除酸水解液體中會抑制酵母菌醱酵之化合物，結果顯示，以固定化鈣離子層析管柱設定沖提液流速 3 mL min-1 配合玉米穗軸水解液饋料體積 1 mL 及管柱溫度 45℃ 時，有較佳分離度，為 63.25% 。濃縮四倍的白玉米穗軸硫酸水解液經固定化鈣離子層析管柱沖提處理，並添加所需營養源，接種 P. caribbica 與 C. guilliermondii 菌液進行醱酵，木糖醇的產率分別為0.39 g g-1 與 0.48 g g -1 ，而未經沖提處理者則測不出木糖醇濃度。

Xylitol, a five carbon sugar alcohol, is one of valuable polyol sweeteners. It can use as a natural food sweetener, a dental caries reducer, and a sugar substitute for diabetics. In the past, xylitol was produced from xylose fermented by suitable microorganisms, but the cost of xylitol is expensive. Therefore, how to develop cheap materials to substitute xylose and maintain the reasonable yield efficiency of xylitol is a necessary research. In this study, Pichia caribbica isolated from soil and Candida guilliermondii collected from BCRC ( Bioresource collection and research center, Taiwan ) to compare the effects of environmental conditions on the productions of xylitol between the two strains and select suitable material to substitute xylose for producing xylitol.
The experimental results showed the suitable conditions for P. caribbica and C. guilliermondii to ferment 15% xylose to produce xylitol were 35℃ and 30℃, 50-100 rpm and 100-150 rpm rotary speeds respectively. When the inoculation ratios of P. caribbica and C. guilliermondii suspensions to cultured medium raised from 1% ( v:v ) to 3% , the xylitol yield efficiencies could increase 0.09 g g-1 respectively.
When xylose containing medium added with 10-20% ( v:w ) glucose and fermented with P. Caribbica the yield efficiency of xylitol increased 1.5 folds that of without adding glucose.
Because the hydrolysate of white corn cob had the highest xylose concentration among the twelve organic materials hydrolyzed with 1% H2SO4, so it was selected for the candidate material of the research. 2.45% xylose was obtained when 50 g L-1 corn cobs was hydrolyzed with 1.5% sulfuric acid under 121℃, 1.1atm and 15 minute condition. After hydrolysis, the hydrolysate concentrated to 4 folds and passed through calcium saturated ion exchange resin to separate xylose from pigment and salt. The result showed when the flow rate of mobile phase was 3 mL min-1 , with loading 1mL each time at 45℃ operation temperature, the separation percentage of xylose could reach 63.25%. After passing through calcium saturated ion exchange the concentrated hydrolysate inoculated with P. caribbica and C. guilliermondii suspension could get 0.39 g g-1 and 0.48 g g-1 yield efficiency respectively.

中文摘要•••••••••••••••••••••••••I
英文摘要•••••••••••••••••••••••••III
誌謝•••••••••••••••••••••••••••V
目錄•••••••••••••••••••••••••• VI
表目錄 •••••••••••••••••••••••••XII
圖目錄 •••••••••••••••••••••••••XI II

第壹章 前言 1
第貳章 前人研究 3
一、 木糖醇的來源、性質與應用 3
二、 用於產製木糖醇之有機物材料 8
（一） 農業廢棄有機物 8
（二） 半纖維素簡介 9
三、 利用木糖生成木糖醇的方法 12
（一） 化學催化法 12
1. 原理 12
2. 製造步驟簡介 12
（二） 微生物醱酵法 16
1. 以酵母菌醱酵法木糖產出木糖醇 16
2. 以真菌醱酵木糖產出木糖醇 17
3. 以細菌醱酵法木糖產出木糖醇 18
四、 影響醱酵木糖產出木糖醇之環境條件 19
（一） 溫度 19
（二） 碳源 19
（三） 氮源 20
（四） 鹽類 21
（五） pH值 21
（六） 菌體量 22
（七） 通氣量 23
五、 抑制木糖醱酵產出木糖醇之物質 24
六、 去除抑制木糖醱酵產出木糖醇之物質的之方法 26
第參章 研究流程、材料及方法 27
一、 菌株篩選之分離與純化、蒐集、保存、選定及菌種鑑定 27
（一） 菌株篩選之分離與純化、蒐集、保存及菌種選定 27
1. 菌株之分離與純化、蒐集及保存 27
(1) 菌株之分離純化及蒐集 27
(2) 菌種保存 28
2. 木糖與木糖醇之定量分析方法及研究用菌株選定 30
(1) 木糖與木糖醇之定量分析方法 30
(2) 研究用菌株之選定 31
（二） 研究用菌株之鑑定 33
1. 菌株基因體DNA ( genomic DNA ) 之萃取 33
2. 菌株基因體26S rDNA之增量、核酸定序及比對鑑定菌種 35
(1) 菌株基因體26S rDNA之增量 35
(2) 增量後之26S rDNA進行定序與比對鑑定菌種 36
二、 農業廢棄有機物之選用及用硫酸水解產出木糖最適化之探討 37
（一） 農業廢棄有機物之選用 37
1. 有機物之前處理 37
2. 有機物以1% 硫酸水解 37
3. 測定木糖濃度之方法與選定研究用之有機物 39
（二） 用硫酸水解玉米穗軸產出木糖最適化之探討 39
1. 探討酸濃度對玉米穗軸產出木糖濃度之影響 39
2. 玉米穗軸與不同比例硫酸混合對產出木糖濃度之影響 39
3. 探討不同水解時間對玉米穗軸產出木糖濃度之影響 40
三、 菌株醱酵木糖產生木糖醇合適條件之探討 41
（一） 探討不同溫度對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 41
（二） 探討添加葡萄糖對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 42
（三） 探討不同濃度木糖與不同繞轉速度對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 42
（四） 探討不同接菌量對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 43
（五） 置換培養基對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 43
四、 探討玉米穗軸酸水解液中醱酵抑制物之去除及其對木糖醇產出之影響 45
（一） 利用固定化鈣離子層析管柱去除酸水解液中之醱酵抑制物之探討 45
1. 固定化鈣離子層析管柱之製備 45
2. 填充管柱及層析系統操作之方式 46
3. 以固定化鈣離子層析管柱去除玉米穗軸酸水解液中鹽類與色素之探討 46
（二） 以陰離子交換樹脂層析管柱去除玉米穗軸酸水解液中鹽類與色素之探討 47
（三） 探討玉米穗軸水解液去除鹽類與色素對木糖醇產出濃度之影響 50
第肆章 結果與討論 51
一、 菌種之選定與鑑定 51
（一） 研究用菌株之選定 51
（二） 菌株基因體26S rDNA經增量、核酸定序比對序列後鑑定之結果 52
二、 農業廢棄有機物之選用及硫酸水解產出木糖之最適化之條件 57
（一） 十二種農業廢棄有機物經1% 硫酸水解後產出木糖濃度 57
（二） 用硫酸水解玉米穗軸產出木糖之最適條件 59
三、 Pichia caribbica與Candida guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之合適條件 63
（一） 不同溫度對P. caribbica與C. guilliermondii 醱酵木糖產出木糖醇之影響 63
（二） 添加葡萄糖對酵母菌P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 67
（三） 不同濃度木糖與繞轉速度對P. caribbica與 C. guilliermondii醱酵木糖產出木糖醇之影響 72
（四） 以不同P. caribbica與 C. guilliermondii菌液比例接種於液體培養基對木糖醇產出量之影響 81
（五） 置換培養基對菌株醱酵木糖產出木糖醇之影響 85
四、 離子交換樹脂去除分離玉米穗軸酸水解液中抑制菌株醱酵木糖產出木糖醇之化合物的效果 88
（一） 以固定化飽和鈣離子層析管柱去除玉米穗軸酸水解液中的色素與鹽類 88
（二） 以陰離子交換樹脂去除分離玉米穗軸酸水解液鹽類與色素之效果 99
（三） 玉米穗軸酸水解液接種酵母菌醱酵產出木糖醇 102
第伍章 結論 108
參考文獻…………………………………………………………..…..110
附錄一…………………………………………………………………118
附錄二…………………………………………………………………134
附錄三…………………………………………………………………150
附錄四…………………………………………………………………151

表目錄

表一、自然界中水果蔬菜及酵母之木糖醇含量 6
表二、木糖醇之物理與化學性質 7
表三、數種用於產出醱酵基質之原料與水解技術 10
表四、以數種絲狀真菌產出木糖醇之結果 17
表五、分離糖醇產出菌 29
表六、本研究用於水解之數種農業廢棄有機質 38
表七、分離菌株之木糖之利用率與木糖醇產出率 54
表八、數種農業廢棄有機物硫酸水解液之木糖含量 58
表九、P. caribbica 與 C. guilliermondii 菌液以不同比例量接種於含10%木糖培養基經醱酵五天後之木糖醇轉化率與產出速率。 85




圖目錄

圖一、產製木糖醇之化學催化法 14
圖二、木糖醇生產技術概觀 15
圖三、酵母菌代謝木糖之路徑圖 17
圖四、木糖脫水形成糠醛之反應式 25
圖五、硫酸水解液以離子交換樹脂層析分離管柱去除醱酵抑制物之裝置圖 49
圖六、酵母菌P. caribbica之26S rDNA於 1% 瓊膠之電泳圖。第一欄為不同分子量之標記核酸，第二與第三欄為P. caribbica 之 26S rDNA核酸 55
圖七、400x顯微鏡下之P. caribbica之菌體型態與大小 56
圖八、玉米穗軸與不同濃度硫酸依固液比1:20混合進行水解，水解液中之木糖濃度 60
圖九、玉米穗軸與1.5% 硫酸依不同之固液比例混合水解時，每克玉米穗軸所能回收之木糖克數 61
圖十、玉米穗軸以不同酸水解時間水解液之木糖濃度 62
圖十一、不同溫度下酵母菌P. caribbica與 C. guilliermondii利用木糖產出木糖醇之重量產率 65
圖十二、不同溫度下酵母菌P. caribbica與 C. guilliermondii利用木糖產出木糖醇之產出速率 66
圖十三、木糖初始濃度為 10% 配合，添加與不添加 1% 葡萄糖供 P. caribbica 醱酵不同天數後醱酵液之木糖、葡萄糖、及木糖醇濃度 68
圖十四、木糖初始濃度為20% 配合，添加與不添加2% 葡萄糖供P. caribbica醱酵不同天數後醱酵液之木糖、葡萄糖、及木糖醇濃度 69
圖十五、木糖初始濃度為10% 配合，添加與不添加1% 葡萄糖供C. guilliermondii醱酵不同天數後醱酵液之木糖、葡萄糖、及木糖醇濃度 70
圖十六、木糖初始濃度為20% 配合，添加與不添加2% 葡萄糖供C. guilliermondii醱酵不同天數後醱酵液之木糖、葡萄糖、及木糖醇濃度 71
圖十七、 10% 木糖接種P. caribbica以100 rpm 繞轉速度與靜置不同天數後，醱酵液之木糖、木糖醇及菌濃度 75
圖十八、 10% 木糖接種 C. guillermondii 以100 rpm 繞轉速度與靜置不同天數後，醱酵液之木糖、木糖醇及菌濃度 76
圖十九、不同濃度木糖接種 P. caribbica 於不同繞轉速度條件下木糖醇的轉化率 77
圖二十、不同濃度木糖接種 C. guilliermondii 於不同繞轉速度條件下木糖醇的轉化率 78
圖二十一、不同濃度木糖接種 P. caribbica 於不同繞轉速度條件下木糖醇的產出速率 79
圖二十二、不同濃度木糖接種 C. guilliermondii 於不同繞轉速度條件下木糖醇的產出速率 80
圖二十三、P. caribbica菌液以不同比例量接種於含 10% 木糖培養基經不同天數後，醱酵液中的木糖與木糖醇濃度 83
圖二十四、C. guilliermondii菌液以不同比例量接種於含 10% 木糖培養基經不同天數後，醱酵液中的木糖與木糖醇濃度 84
圖二十五、 P. caribbica與C. guilliermondii每隔三天置換接種於含10% 木糖培養基經不同置換次後之木糖醇轉化率 87
圖二十六、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積1 mL 與層析管柱溫度設定為40℃ 90
圖二十七、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積2 mL 與層析管柱溫度設定為40℃ 91
圖二十八、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為40℃ 92
圖二十九、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速5 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為40℃ 93
圖三十、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速1 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為45℃ 94
圖三十一、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速2 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為45℃ 95
圖三十二、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為45℃ 96
圖三十三、玉米穗軸水解液流經固定化鈣離子飽和層析管柱之後液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速5 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為45℃ 97
圖三十四、不同饋料體積之玉米穗軸酸水解液流經固定化飽和鈣離子層析管柱 ( 溫度設定為 40℃ 與 45℃ ) 後木糖可與色素化合物和鹽類分離的相對百分率 98
圖三十五、玉米穗軸水解液流經A103S陰離子層析管柱之後，液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積3 mL 與層析管柱溫度設定為25℃ 100
圖三十六、玉米穗軸水解液流經A103S陰離子層析管柱之後，液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積6 mL 與層析管柱溫度設定為25℃ 101
圖三十七、玉米穗軸水解液流經A103S陰離子層析管柱之後，液體之相對電導度雨木糖濃度。操作條件為沖提液流速3 mL min-1配合饋料體積15 mL 與層析管柱溫度設定為25℃ 102
圖三十八、以P. caribbia醱酵玉米穗軸硫酸 ( 1.5% ) 水解液醱酵液中的木糖與木糖醇的濃度及菌之OD值 104
圖三十九、以 C. guilliermondii醱酵玉米穗軸硫酸 ( 1.5% ) 水解液醱酵液中的木糖與木糖醇的濃度及菌之OD值 105
圖四十、以P. caribbica醱酵經固定化鈣離子交換樹脂層析之玉米穗軸硫酸( 1.5% ) 水解液後，醱酵液中的木糖與木糖醇濃度及菌OD值 106
圖四十一、以C. guilliermondii醱酵經固定化鈣離子交換樹脂層析之玉米穗軸硫酸 ( 1.5% ) 水解液後，醱酵液中的木糖與木糖醇濃度及菌OD值 107

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