臺灣博碩士論文加值系統

靈芝在東亞是傳統的藥用真菌，擁有悠久的應用歷史。根據現代研究發現靈芝主要成分為靈芝多醣(Ganoderma polysaccharides)與靈芝三萜(Ganoderma triterpenes)。靈芝三萜對於人的身體具有抗腫瘤、保肝、抗高血壓、降膽固醇、抗HIV與抗組織胺等多重作用。雖然靈芝的研究非常多，但多數研究都是靈芝對其他種疾病的治療功效或者靈芝多醣的提取與功效。對於靈芝三萜合成基因的研究卻十分稀少。在2012年中國大陸北京和湖南的兩間大學分別對兩個品種的靈芝基因體完成定序，使我們可透過比較基因體的方式來對靈芝三萜的合成路徑與合成基因進行研究。
為了解靈芝三萜的合成路徑，我們透過分析靈芝細胞色素P450功能的相關文獻、比對KEGG反應路徑資料庫、靈芝基因體、GenBank基因與蛋白質資料庫等幾種靈芝三萜合成基因資料來源，建構出靈芝三萜之可能合成路徑，再透過這些細胞色素P450基因在菌絲體與子實體的表現量差異，選出可能合成靈芝三萜的六個細胞色素P450基因。最後我們設計引子利用聚合酶連鎖反應進行實際基因存在性驗證，並與NCBI GenBank核酸資料庫進行比對分析確認其身份。

The basidiomycete white rot fungus Ganoderma lucidum (Leyss ex fr) Karst (Lingzhi; Reishi) has been used for long time in East Asia. Modern research suggests that the main harmacological components are Ganoderma polysaccharides and Ganoderma triterpenoids. Ganoderma triterpenoids possessed many biomedical effects such as anti-tumor, liver, antihypertensive, cholesterol-lowering, anti-HIV and anti-histamine. Although a lot of studies were done about Ganoderma, the focus is on the biomedical activities of their extracts. However, few studies were done on the synthesizing mechanism and biological pathways of Ganoderma triterpenoids. In 2012, two genomes of G. lucidum were sequenced by two research groups in China, which enable us to study the synthesizing mechanism of Ganoderma triterpenoids using comparative genomics. In this paper, possible genes involved in the synthesizing of Ganoderma triterpenoids were discovered using the KEGG, UniProt, and GenBank databases, and two G. lucidum genomes. Six P450 genes which may involve in the synthesizing of Ganoderma triterpenoids were also derived by comparing the expression profiles of the aerial mycelia of dikaryons and fruiting bodies. Polymerase chain reaction experiments were performed to verify the existence of these genes. Based on the experiment results, a putative pathway model for the synthesizing of Ganoderma triterpenoids is constructed.

目錄
1. 緒論 1
2. 相關研究 4
2.1. 靈芝酸的結構與命名 4
2.2. 靈芝酸的表現量與功效 5
2.3. 靈芝三萜含量相關研究 7
2.4. 靈芝三萜的合成基因 9
3. 靈芝與靈芝三萜 11
3.1. 靈芝簡介 11
3.2. 靈芝三萜的結構 12
4. 靈芝三萜的合成 15
4.1. 靈芝三萜的合成生化反應路徑 15
4.2. 靈芝三萜合成酶細胞色素P450 20
4.3. 靈芝三萜合成相關基因 20
5. 材料與方法 24
5.1. 靈芝菌絲體的培養 24
5.2. 抽取靈芝DNA之方法 25
5.3. 測靈芝DNA含量 27
5.4. 靈芝三萜合成路徑合成酶基因之引子設計 28
5.5. 聚合酶連鎖反應 31
6. 結果 32
6.1. 靈芝三萜合成路徑之合成酶基因之聚合酶連鎖反應 32
6.2. 靈芝三萜合成基因定序結果 35
6.3. 靈芝三萜合成基因與核酸資料庫比對結果 35
6.4. 六個細胞色素P450合成酶與核酸資料庫比對結果 39
7. 結論 42
8. 未來展望 43
9. 參考文獻 44
附錄A. 各種靈芝酸與相關物結構 46
A.1 28種靈芝酸結構 46
A.2 5種靈芝烯酸結構 49
A.3 3種靈赤酸結構 50
A.4 5種赤芝酸結構 51
A.5 2種靈芝醇結構 52
A.6 3種赤芝醛結構 52
附錄B. 靈芝三萜合成路徑相關基因之蛋白質序列 53
B.1 第一階段 53
B.1 第二階段 55
附錄C. 靈芝的靈芝三萜合成路徑定序結果 57

表目錄
表 1：靈芝三萜的生物活性[6] 6
表 2 靈芝三萜的種類 13
表 3：28種靈芝酸的側鏈差異[12] 14
表 4：NCBI Genome基因體資料庫中與Ganoderma lucidan同為多孔菌目真菌的基因體 21
表 5：KEGG中酵母菌與靈芝三萜合成路徑相關之同源基因 22
表 6：靈芝與酵母菌同源基因之基因座代號對照表 23
表 7：配制靈芝菌絲體固態培養基的材料[34] 24
表 8：配制靈芝菌絲體培養液的材料[34] 24
表 9：緩衝溶液的配置 26
表 10：螢光定量(Qubit®)的測序品質結果 28
表 11：甲羥戊酸合成路徑基因引子與預計產物長度 29
表 12羊毛甾醇合成路徑基因引子與預計產物長度 29
表 13：靈芝酸合成路徑中六種細胞色素P450基因之引子與預計產物長度 30
表 14：靈芝的靈芝三萜合成路徑定序整理 35
表 15靈芝三萜合成路徑的相關基因與核酸資料庫進行比對結果 37
表 16六個細胞色素P450與核酸資料庫進行比對結果 40

圖目錄
圖 1 (a)神農本草經[1] (b)本草綱目[4] 2
圖 2至2015年2月現代SCI中找尋到的三萜類文章數量[5] 2
圖 3靈芝的科學分類 11
圖 4羊毛甾醇變成靈芝三萜主要五種架構Ⅰ~Ⅴ[33]。 12
圖 5主要結構中的Ι型為主結構，進行下表的整理[33]。 13
圖 6靈芝三萜合成路徑 16
圖 7靈芝三萜合成路徑之第一階段甲羥戊酸合成路徑。 17
圖 8靈芝三萜合成路徑之第二階段羊毛甾醇合成路徑。 18
圖 9靈芝三萜合成路徑之第三階段靈芝酸合成路徑。 19
圖 10：聚合酶連鎖反應溫度與反應時間設定。 31
圖 11利用聚合酶連鎖反應確認甲羥戊酸合成路徑基因片段長度 32
圖 12利用聚合酶連鎖反應確認羊毛甾醇合成路徑中基因的片段長度 33
圖 13利用聚合酶連鎖反應確認靈芝酸合成路徑中羊毛甾醇合成酶與細胞色素P450，合成6個靈芝酸基因的片段長度 34
圖 14 聚合酶連鎖反應結果與靈芝三萜合成路徑流程圖 41

9.參考文獻
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