臺灣博碩士論文加值系統

中文摘要

為了瞭解胰島β-細胞中粒線體生合成對胰島素分泌的機轉，本研究探討粒線體功能異常是否會影響β-細胞胰島素的分泌。本實驗利用大鼠胰島β-細胞，RIN-m5F細胞，運用RNA干擾技術 (RNA interference，RNAi)，以短暫轉染(transient transfection)方式干擾粒線體轉錄因子A mRNA (mitochondrial transcription factor A, TFAM)，以期降低粒線體DNA複製與轉錄，進而影響粒線體呼吸傳遞鏈功能，使ATP生成降低，影響胰島素分泌。經過兩次轉染，以同步定量聚合酶鏈鎖反應 (real-time PCR) 進行分析，轉染後第4小時起，開始抑制TFAM mRNA的表現，最高可抑制99 %，在第48 ~ 72小時，也觀察到TFAM mRNA下降53.3 %，並影響粒線體轉錄之ND6 mRNA（NADH-uibiquinone oxidoreductase subunit 6 , ND6）表現量下降，僅剩原本之15 %；同時也觀察到粒線體DNA拷貝數的下降。粒線體轉譯之呼吸傳遞鏈複合體四中次單位COX I (cytochrome c oxidase, subunit I)也顯著降低27 %，可能導致粒線體呼吸傳遞鏈功能缺失，進而使胰島素分泌降低，可用於模擬第二型糖尿病人粒線體功能不全的情形。本研究利用100 ng/mL溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr)破壞RIN-m5F細胞粒線體DNA作為另一研究模式，25天後觀察到粒線體DNA拷貝數僅剩0.13 %。以EtBr處理五個月後，明顯觀察到細胞因粒線體DNA被破壞後，生長速度趨於緩慢，進一步利用葡萄糖、白胺酸(Leucine)、精胺酸(Arginine)來刺激經EtBr處理的RIN-m5F細胞，ATP的生成明顯降低，且胰島素分泌趨於減少，推測應為粒線體功能異常，ATP無法正常生成進而影響胰島素分泌。本研究顯示粒線體DNA套數減少及粒線體基因的表現受到抑制皆會導致粒線體功能異常進而影響β-細胞胰島素分泌情形。

Abstract

To examine the impact of mitochondrial dysfunction on insulin secretion of pancreatic b–cell, multiple RIN-m5F cell clones with mitochondrial DNA (mtDNA) depletion by RNA interference (RNAi) or ethidium bromide (EtBr) treatment were created. The mitochondrial transcription factor A (TFAM) were presented to regulate mtDNA replication and transcription process. It could affect the ATP production from respiratory chain reaction, and insulin secretion in the pancreatic b–cell. In this study, related genes mRNA expression and mtDNA copy number were determined by real-time quantitative PCR analysis. The mRNA expression levels of TFAM and mtDNA-encoded NADH-uibiquinone oxidoreductase subunit 6 (ND6) were significantly decreased after transient transfection of siRNA 4 to 72 hours. TFAM gene expression was disrupted up to 99 % and decreased to 53.3 % of TFAM after twice siRNA transfection. Both of mtDNA copy number (10 % of control after 64 h transfection) and mtRNA expression (reduced 85 % of ND6 mRNA) were swayed by defective mitochondrial biogenesis. RIN-m5F cells characterized with slow growth rate, reduced nutrients (glucose, leucine, arginine)-induced insulin secretion and ATP synthesis after EtBr treatment over 5 months. We suggested that both mtDNA depletion and reduced mitochondrial genes expression may compromise mitochondrial function and disrupt insulin secretion by pancreatic b–cell.

目錄
中文摘要 I
Abstract III
致謝 IV
縮寫表(Abbreviations) VI
目錄 VIII
表目次 XII
圖目次 XIII
第一章 緒論 1
第一節 研究動機 1
第二節 研究目的 3
第二章 文獻回顧 4
第一節 粒線體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 4
第二節 粒線體轉錄因子A調控粒線體DNA 5
第三節 粒線體轉錄因子A、粒線體DNA與糖尿病之相關性 6
第四節 胰臟β-細胞中粒線體功能不健全之影響 7
第五節 胰臟β-細胞中胰島素分泌之機轉 8
第六節 RNA干擾技術(RNAi) 9
第三章 實驗材料與方法 11
第一節 實驗流程 11
第二節 細胞培養 13
2.1細胞株RIN-m5F 13
2.2培養方式 13
第三節 siRNA設計 13
3.1 目標基因 13
3.2 製備方式 14
第四節 短暫轉染(transient transfection) 15
第五節 EtBr處理細胞 16
第六節 細胞計數 16
第七節 DNA萃取與定量 17
第八節 細胞RNA萃取與定量 18
第九節 反轉錄(reverse transcription) 19
第十節 細胞蛋白質萃取與定量 19
第十一節 聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 20
11.1 引子設計 20
11.2聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction, PCR) 20
第十二節 同步定量聚合酶鏈鎖反應(Real-time quantitative PCR) 21
12.1 標準品之製作 21
12.2 定量標準品與樣本 21
第十三節 TFAM抗體製作 22
第十四節 西方點墨法(Western blot) 24
第十五節 ATP生成量與胰島素分泌量之測定 26
15.1 實驗流程 26
15.2 細胞胰島素分泌測定 26
15.3 細胞內ATP生成量之測定 26
第十六節 統計分析 27
第四章 結果 28
第一節 一次短暫轉染對於TFAM mRNA 與呼吸傳遞鏈中基因表現之影響 28
1.1 siRNA抑制TFAM mRNA表現情形 28
1.2 TFAM309組中呼吸傳遞鏈中基因mRNA表現情形 29
第二節 兩次轉染TFAM mRNA與呼吸傳遞鏈中mRNA之影響 29
2.1 siRNA抑制TFAM mRNA表現及TFAM 29
2.2 TFAM mRNA下降對於TFAM蛋白的表現影響 30
2.3 siRNA抑制TFAM mRNA對粒線體DNA轉錄之ND6影響 30
第三節 siRNA抑制TFAM mRNA對粒線體DNA拷貝數之影響 31
第四節 siRNA抑制TFAM mRNA對呼吸傳遞鏈酵素蛋白影響 32
第五節 以EtBr破壞RIN-m5F細胞粒線體DNA之影響 33
5.1 EtBr處理後RIN-m5F細胞生長情形 33
5.2 EtBr破壞RIN-m5F細胞粒線體DNA情形 33
5.3 EtBr處理後粒線體DNA轉譯蛋白COX I表現 33
5.4 營養素刺激EtBr處理之細胞ATP生成與胰島素分泌情形 34
第五章 討論 36
第一節 以siRNA短暫轉染抑制TFAM mRNA成效探討 36
第二節 TFAM mRNA降低影響呼吸傳遞鏈基因表現之影響 37
第三節 TFAM降低對於粒線體DNA拷貝數之影響 38
第四節 TFAM降低對於呼吸傳遞鏈蛋白質表現之影響 40
第五節 胰臟b-細胞中EtBr破壞粒線體DNA之影響 41
第六章 結論 44
第七章 參考文獻 45


表目次

表一：siRNA序列與進行體外轉錄siRNA的DNA基因序列 48
表二：分析粒線體DNA轉錄基因之RT-PCR及real-time PCR引子序列 49
表三：分析細胞核染色體DNA轉錄基因之RT-PCR或real-time PCR之引子序列 50
表四：西方點墨法分析使用之一級抗體 51
表五：西方點墨法分析使用之二級抗體 52

圖目次
圖一：大鼠粒線體DNA圖 53
圖二：大鼠粒線體轉錄因子A 54
圖三：RNA干擾作用機轉 55
圖四：TFAM225--TFAM mRNA基因表現量 56
圖五：TFAM309--TFAM mRNA基因表現量 57
圖六：TFAM694--TFAM mRNA基因表現量 58
圖七：TFAM309--ND1 mRNA基因表現量 59
圖八：TFAM309--COX I mRNA基因表現量 60
圖九：TFAM309--COX VIc mRNA基因表現量 61
圖十：TFAM309--TFAM mRNA基因表現量 62
圖十一：TFAM694--TFAM mRNA基因表現量 63
圖十二：TFAM309--TFAM蛋白質表現量 64
圖十三：TFAM694--TFAM蛋白質表現量 65
圖十四：TFAM309--ND6 mRNA基因表現量 66
圖十五：TFAM694--ND6 mRNA基因表現量 67
圖十六：TFAM309--粒線體DNA拷貝數 68
圖十七：TFAM694--粒線體DNA拷貝數 69
圖十八：TFAM309--COX I蛋白質表現量 70
圖十九：TFAM694--COX I蛋白質表現量 71
圖二十：TFAM309--Flavoprotein蛋白質表現量 72
圖二十一：TFAM309--COX VIc蛋白質表現量 73
圖二十二：TFAM694--Flavoprotein蛋白質表現量 74
圖二十三：TFAM694--COX VIc蛋白質表現量 75
圖二十四：細胞生長曲線 76
圖二十五：EtBr-treated之粒線體DNA拷貝數 77
圖二十六：EtBr-treated之COX I、Flavoprotein、COX VIc、TFAM蛋白表現量 78
圖二十七：葡萄糖刺激下細胞內ATP生成量與胰島素分泌量。 79
圖二十八：精胺酸刺激下細胞內ATP生成量與胰島素分泌量。 80
圖二十九：白胺酸刺激下細胞內ATP生成量與胰島素分泌量。 81

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