臺灣博碩士論文加值系統

食道癌在台灣為癌症前十大死因之一，行政院衛生署於民國98年公布癌症死因中，食道癌排行第八。
食道癌的死亡率相當高，主因係難以早期發現治療所導致。
目前針對食道癌細胞的第一線藥物順鉑(cisplatin)其副作用及毒性過大，故發展新藥用以治療食道癌為目前重要的課題。
牛樟芝已被證實有多種生理活性，尤其以抗腫瘤的部分最為受人矚目，並經許多研究證實其抗癌功效。
本實驗從牛樟芝子實體粗萃取物經管柱層析得到的分離物FK1、FK2、FK3-1、FK3-2、FK4、FK5、FK6。
將上述的樣品對食道癌細胞株CE81T/VGH及正常纖維母細胞株CCD-966SK進行細胞毒性測試，得知FK4為有效抑制CE81T/VGH且對CCD-966SK較無抑制作用之成分。FK4再經純化取得主成分K4-2，並再以細胞毒性測試證實K4-2具有FK4的效果。
將順鉑對CE81T/VGH及CCD-966SK作細胞毒性測試，得知順鉑對CE81T/VGH有極佳的效果，對CCD-966SK也有相當的毒性。
以K4-2合併順鉑對CE81T/VGH作細胞毒性測試，將K4-2濃度控制在單純使用K4-2時半抑制率時濃度(IC50)的一半，再以不同濃度的順鉑作處理，發現在此情況下順鉑的IC50剛好也是單純使用順鉑時的一半，顯示順鉑與K4-2合併使用時對CE81T/VGH的抑制效果不會有變化。另外再作合併順鉑與K4-2對正常細胞株CCD-966SK的細胞毒性測試，發現在固定K4-2濃度的情況下，順鉑在較低濃度時對CCD-966SK較單純使用同濃度的順鉑要來得更低，顯示K4-2可以降低順鉑對正常細胞株CCD-966SK的毒性。
以K4-2對CE81T/VGH作處理，進行細胞週期測試及細胞凋亡測試，得知隨著K4-2濃度上升，CE81T/VGH的細胞週期停滯以及細胞凋亡的情形皆有明顯上升。
以西方墨點法偵測相關路徑蛋白，結果顯示caspase-3、caspase-8、caspase-9、cytochrome C、Bax、p21的表現量隨著K4-2濃度上升而增加；p53 、CDC2、cyclin B則是隨著K4-2濃度上升而減少。
以RT-PCR偵測相關路徑mRNA表現，結果顯示caspase-3、caspase-8、caspase-9皆隨著K4-2濃度上升而增加，與西方墨點法的結果相符；DR4、TNFRSF1B也隨著K4-2濃度上升而增加。
綜合上述結果，得知K4-2是經由DR4及TNFRSF1B誘發caspase-8的表現，casepase-8再活化Bax，引發粒線體路徑，釋放cytochrome C，使caspase-9活化，並活化caspase-3，造成細胞凋亡。另外K4-2也會活化p21， p21會抑制細胞週期蛋白CDC2和cyclin B，並造成細胞週期的停滯。
由以上證實K4-2對於食道癌細胞株CE81T/VGH具有極佳毒殺效果，在未來K4-2有機會發展成直接治療或輔助目前第一線抗癌用藥。

The esophageal carcinoma is one of the top ten leading causes of cancer death in Taiwan. It was ranked eighth in cause of cancer death from the statistics of Department of Health, Executive Yuan, R.O.C. (Taiwan) in 2009.
The main reason for high mortality rate of esophageal carcinoma was difficulty in early detection and treatment at the early stages.
Taiwanofungus camphoratus has been identified to have many physiological activities, especially the anti-tumor effect was the most attention by the people.
In this study, we got several column chromatography fractions from Taiwanofungus camphoratus crude extract: FK1, FK2, FK3-1, FK3-2, FK4, FK5, and FK6 respectively.
The above fractions were first used to test their cellular toxicity on esophageal carcinoma cell line CE81T/VGH and human normal skin fibroblast cell line CCD-966SK. The primary results showed FK4 was the most effective one to CE81T/VGH and less inhibition to CCD-966SK. K4-2, further purified from FK4, had more toxicity to CE81T/VGH than FK4 but no inhibition to normal cell CCD-966SK.
Combined K4-2 and cisplatin for cell toxicity test on CE81T/VGH and CCD-966SK. The results showed that combination of K4-2 and cisplatin did not reduce the inhibition to CE81T/VGH. But comparing with pure cisplatin, the combination of K4-2 and cisplatin showed lower toxicity to CCD-966SK.
The result of cell cycle and apoptosis assay on CE81T/VGH showed that K4-2 had significant effects to trigger apoptosis and cell cycle arrest at G2/M.
The results of western blot assay showed that K4-2 could up-regulate caspase-3, caspase-8, caspase9, cytochrome C, Bax and p21, and down-regulate p53, CDC2 and cyclin B.
By using RT-PCR assay to detect mRNA expression of CE81T/VGH, the results showed that K4-2 could up-regulate caspase-3, caspase-8, caspase-9. The results from RT-PCR assay were match to the results from western blot assay. K4-2 also could up-regulate DR4 and TNFRSF1B, the receptors on cell surface.
On the basis of the above results, it showed that K4-2 up-regulates DR4, TNFRSF1B, caspase-8, Bax, then Bax up-regulates mitochondrial pathway to release cytochromc C, cytochrome C combines with caspase-9, activated caspase-3, and finally induced apoptosis. K4-2 also up-regulates p21, which inhibits CDC2 and cyclin B, and results in cell cycle arrest.
Since the K4-2 was identified to have the excellent cytotoxic effects on CE81T/VGH in this study, it should have the opportunity to develop for treatment or assist with current anti-cancer drugs.

誌謝••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••I
中文摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••II
英文摘要•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••IV
總目錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••VII
圖目錄•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••IX
表目錄•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••XIII
壹、 前言•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••1
貳、 文獻回顧•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
一、 食道癌簡介••••••••••••••••••••••••••••••••••••2
二、 牛樟芝簡介••••••••••••••••••••••••••••••••••••5
三、 細胞凋亡介紹•••••••••••••••••••••••••••••••••11
四、 細胞週期簡介•••••••••••••••••••••••••••••••••14
五、 腫瘤抑制基因p53••••••••••••••••••••••••••••••15
六、 順鉑介紹•••••••••••••••••••••••••••••••••••••18
參、 研究目的••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••20
肆、 實驗材料與儀器••••••••••••••••••••••••••••••••••••21
伍、 實驗方法••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••29
一、 牛樟芝子實體成分的萃取與分離、純化••••••••••••29
二、 細胞株的培養•••••••••••••••••••••••••••••••••32
三、 細胞存活率測試•••••••••••••••••••••••••••••••34
四、 流式細胞儀偵測細胞週期•••••••••••••••••••••••35
五、 流式細胞儀偵測細胞凋亡•••••••••••••••••••••••36
六、 偵測DNA片段化••••••••••••••••••••••••••••••37
七、 蛋白質電泳及西方墨點法偵測細胞作用路徑•••••••38
八、 以逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)偵測細胞作用路徑相關RNA表現•••••••••••••••••••••••••••••••••41
九、 數據統計•••••••••••••••••••••••••••••••••••••44
陸、 結果與討論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••45
一、 細胞存活率測試結果•••••••••••••••••••••••••••45
二、 細胞週期測試結果•••••••••••••••••••••••••••••46
三、 細胞凋亡測試結果•••••••••••••••••••••••••••••47
四、 細胞形態觀察結果•••••••••••••••••••••••••••••48
五、 DNA片段化測試結果•••••••••••••••••••••••••••48
六、 偵測K4-2誘導細胞凋亡相關路徑結果•••••••••••••49
柒、 結論••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••79
捌、 未來展望••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••81
參考文獻•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••82
附錄••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••89

圖目錄

(圖2-1) 食道癌的分期•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••4
(圖2-2) 親緣關係樹顯示牛樟芝BCRC35396被分類於Taiwanofungus群組而非Antrodia群組••••••••••••••••••••••••••••••••••••••7
(圖2-3) 牛樟芝子實體的外形•••••••••••••••••••••••••••••••••8
(圖2-4) 細胞凋亡的過程••••••••••••••••••••••••••••••••••••12
(圖2-5) 細胞週期••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••14
(圖2-6) p53造成細胞凋亡的路徑•••••••••••••••••••••••••••••16
(圖2-7) p53造成細胞週期停滯及細胞凋亡的途徑•••••••••••••••17
(圖2-8) 順鉑在細胞內與DNA的結合作用••••••••••••••••••••18
(圖6-1)牛樟芝粗萃取物crude extract的HPLC分析圖譜••••••••••50
(圖6-2)牛樟芝粗萃取分離物FK4的HPLC分析圖譜•••••••••••••50
(圖6-3) 牛樟芝粗萃取分離物K4-2的HPLC分析圖譜•••••••••••51
(圖6-4)牛樟芝子實體粗萃取物(crude extract)對CE81T/VGH的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••51
(圖6-5)牛樟芝子實體粗萃取物的各種分離物對CE81T/VGH的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••52
(圖6-6)牛樟芝子實體粗萃取物的分離物FK2、FK4對CE81T/VGH的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••52
(圖6-7)牛樟芝子實體粗萃取分離物FK4經純化後得到的K4-2對CE81T/VGH的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••53
(圖6-8)市面抗癌藥物順鉑(cisplatin)對CE81T/VGH的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••53
(圖6-9) FK2、FK4、K4-2、順鉑對正常纖維母細胞株CCD-966SK的24小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••54
(圖6-10)牛樟芝子實體粗萃取分離物FK4經純化後得到的K4-2對CE81T/VGH的48小時細胞毒性測試結果•••••••••••••••••••••54
(圖6-11) 將K4-2與順鉑合併使用，對CE81T/VGH作細胞毒性測試的結果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
(圖6-12) 將K4-2與順鉑合併使用，對CCD-966SK作細胞毒性測試的結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••55
(圖6-13) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞週期測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••56
(圖6-14) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞週期測試結果量化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••57
(圖6-15) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞凋亡測試結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••57
(圖6-16) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞凋亡測試結果量化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••58
(圖6-17) CE81T/VGH以K4-2處理24小時後以倒立式顯微鏡於可見光下檢測結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••59
(圖6-18) CE81T/VGH以K4-2處理48小時後以倒立式顯微鏡於可見光下檢測結果•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••60
(圖6-19) CE81T/VGH以6 µg/ml K4-2分別處理12、24、48小時的DNA片段化測試結果••••••••••••••••••••••••••••••••••••••61
(圖6-20) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-3蛋白的表現••62
(圖6-21) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-3蛋白切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••63
(圖6-22) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-8蛋白及caspase-8切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••63
(圖6-23) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-9蛋白及caspase-9切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••64
(圖6-24) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後cytochrome C蛋白的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••65
(圖6-25) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Bax蛋白的表現•••••••66
(圖6-26) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Bid蛋白的表現•••••••66
(圖6-27) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後CDC2蛋白的表現•••••67
(圖6-28) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後cyclin B1蛋白的表現••68
(圖6-29) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p21蛋白的表現•••••••68
(圖6-30) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p53蛋白的表現•••••••69
(圖6-31) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後bcl-2 mRNA的表現•••70
(圖6-32) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-3 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••70
(圖6-33) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-8 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••71
(圖6-34) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-9 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••72
(圖6-35) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR3 mRNA的表現••••73
(圖6-36) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR4 mRNA的表現••••73
(圖6-37) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR5 mRNA的表現••••74
(圖6-38) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Fas mRNA的表現•••••75
(圖6-39) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p53 mRNA的表現•••••75
(圖6-40) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後TNFRSF1A mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••76
(圖6-41) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後TNFRSF1B mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••77
(圖6-42) K4-2經由P21誘導細胞週期停滯在G2/M期•••••••••••78
(圖6-43) K4-2經由DR4、DR5誘導細胞凋亡的途徑•••••••••••••78

(附錄1) FK1的HPLC圖譜•••••••••••••••••••••••••••••••••89
(附錄2) FK2的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••••89
(附錄3) FK3-1的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••90
(附錄4) FK3-2的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••90
(附錄5) FK4的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••••91
(附錄6) FK5的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••••91
(附錄7) FK6的HPLC圖譜••••••••••••••••••••••••••••••••92
 
表目錄

(表4-1)實驗材料 (三) 試劑•••••••••••••••••••••••••••••••••22
(表4-2)實驗材料 (四) 抗體•••••••••••••••••••••••••••••••••24
(表4-3)實驗材料 (五) 耗材•••••••••••••••••••••••••••••••••24
(表4-4)實驗材料 (六) PCR引子••••••••••••••••••••••••••••••25
(表4-5)實驗儀器•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••26

(表5-1) 矽膠管柱層析的沖提液濃度比與9種Fraction 的成分含量•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••31
(表5-2) 將FK4純化為K4-2的分析梯度•••••••••••••••••••••••32
(表5-3) 配製提供4組樣品時所需的A管試劑總量••••••••••••••43
(表5-4) 配製提供4組及其倍數樣品時所需B管的試劑總量••••••43
(表6-1) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞週期測試結果量化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••56
(表6-2) CE81T/VGH以不同濃度K4-2處理48小時的細胞凋亡測試結果量化•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••58
(表6-3) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Caspase-3蛋白及Caspase-3切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••62
(表6-4) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Caspase-8蛋白及Caspase-8切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••63
(表6-5) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase 9蛋白及caspase 9切位的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••64
(表6-6) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後cytochrome C蛋白的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••65
(表6-7) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Bax蛋白的表現••••••••65
(表6-8) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Bid蛋白的表現••••••••66
(表6-9) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後CDC2蛋白的表現••••••67
(表6-10) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後cyclin B1蛋白的表現••67
(表6-11) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p21蛋白的表現•••••••68
(表6-12) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p53蛋白的表現•••••••69
(表6-13) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後bcl-2 mRNA的表現•••69
(表6-14) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-3 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••70
(表6-15) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-8 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••71
(表6-16) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後caspase-9 mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••72
(表6-17) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR3 mRNA的表現••••72
(表6-18) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR4 mRNA的表現••••73
(表6-19) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後DR5 mRNA的表現••••74
(表6-20) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後Fas mRNA的表現•••••74
(表6-21) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後p53 mRNA的表現•••••75
(表6-22) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後TNFRSF1A mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••76
(表6-23) K4-2處理CE81T/VGH 24小時後TNFRSF1B mRNA的表現•••••••••••••••••••••••••••••••••77

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