臺灣博碩士論文加值系統

日本腦炎病毒為具有套膜的單股正向RNA病毒，屬於黃病毒科之黃病毒屬，病毒通過三家斑紋叮咬而傳播。儘管現在已經有疫苗可以預防得到這個疾病，但是全世界每年仍有約50,000感染的案例。對於日本腦炎尚未開發出相關的抗病毒藥物，目前沒有有效的治療日本腦炎，只有臨床支持上的治療。根據先前文獻發現咖啡酸對於C型肝炎、A型流感，具有抑制病毒的增值的作用。我們欲研究咖啡酸與其七種類衍物之抗日本腦炎病毒功效與機制。首先利用MTT assay單獨去看這8項藥物對於細胞本身是否有毒殺性。100µM藥物處理時，除了Gallic acid對細胞有毒殺影響，其他的藥物對於細胞本身沒有毒殺。接著利用病毒(MOI=0.5)感染細胞時，立即加入不同濃度的藥物培養，在感染36小時後觀察病毒引發細胞病變作用(cytopathic effect，CPE)現象，發現caffeic acid(CA)、chlorogenic acid(CH)、gallic acid(GA)和ascorbic acid(AS)具有濃度依賴性抑制CPE現象。接著，利用流式細胞儀檢測日本腦炎病毒感染引發細胞凋亡(sub-G1細胞)的情形，在10 µM caffeic acid、1µ M chlorogenic acid、50 µM gallic acid、5 µM ascorbic acid時，抑制50%以上細胞凋亡。病毒斑點試驗(plaque assay)測定上清液中病毒產量(virus yield)發現此2種合成物具有濃度依賴性抑制病毒產量，其IC50分別為2.56 µM caffeic acid、 4.62 µM chlorogenic acid、＜1µM gallic acid、>1µM ascorbic acid。Time-of-addition 試驗結果顯示在先給藥1小時再感染病毒模式下，其IC50分別為2.12 µM caffeic acid、1.95 µM chlorogenic acid、2.02 µM gallic acid及2.61µM ascorbic acid。在先感染病毒1小時再給藥模式下，其IC50分別為2.04 µM caffeic acid、2.94 µM chlorogenic acid、4.25 µM gallic acid和4.4 µM ascorbic acid。利用Virucidal activity和Viral attachment實驗發現在1µM caffeic acid 以及5µM chlorogenic acid作用下抑制病毒貼附以及毒殺約80%。Caffeic acid和chlorogenic acid在先給藥和後給藥的條件下具有最佳抗日本腦炎病毒能力，有助益於預防以及治療的日本腦炎。

Japanese encephalitis virus (JEV) is an enveloped, single stranded and positive-sense RNA virus, belonging to the family Flaviviridae. Although JEV vaccines are available, there are still annually about 50,000 Japanese encephalitis (JE) cases worldwide. Currently, there is no effective treatment for treatment of JE, only supportive treatment is used for clinical applications. Previous literatures reported that caffeic acid has inhibitory effects on propagation of hepatitis C virus, influenza A virus, and herpes simplex virus. This study investigated on anti-JEV activity and mechanism of caffeic acid(CA) and its seven analogs (chlorogenic acid(CH), vanillic acid(VA), ferulic acid(FE), gallic acid(GA), caffeic acid phenethyl ester(CAP), cinnamic acid(CI), and ascorbic acid(AS)). MTT assay indicated that caffeic acid and its analogs, except gallic acid, were less toxic to TE671 cells. Cytopathic effect (CPE) reduction assay demonstrated that caffeic acid, chlorogenic acid, gallic acid, and ascorbic acid concentration-dependently reduced JEV-induced CPE at a MOI of 0.5. Flow cytometry with propidium iodide staining revealed that the inhibitory effect of these four compounds on JEV-induced apoptosis was similar to the action against JEV-induced CPE. Plaque formation assay indicated IC50 values against JEV yield were 2.56 µM caffeic acid, 4.62 µM chlorogenic acid, respectively. In pre-treatment assay (1 h prior to infection), IC50 values against JEV plaque formation were 2.12 µM caffeic acid, 1.95 µM chlorogenic acid, 2.02 µM gallic acid and 2.61 µM ascorbic acid, respectively. In post-treatment assay (1 h post infection), IC50 values against JEV plaque formation were 2.04 µM caffeic acid, 2.94 µM chlorogenic acid, 4.25 µM gallic acid and 4.4 µM ascorbic acid, respectively. Caffeic acid and chlorogenic acid showed the best antiviral activity among these eight compounds, as useful for preventative and therapeutic agents against JE.

目錄
致謝………………………………………………………………………I
中文摘要………………………………………………………………II
英文摘要………………………………………………………………. III
第一章、 緒論…………………………………………………………. 1
第一節、研究背景……………………………………………………1
一、 日本腦炎病毒………………………………………………1
二、 日本腦炎病毒的生命週期…………………………………1
三、 日本腦炎病毒的基因體與病毒結構………………………2
四、 日本腦炎臨床症狀…………………………………………3
五、 日本腦炎疫苗及藥物………………………………………4
六、 干擾素………………………………………………………4
七、 咖啡酸類衍物………………………………………………5
第二節、 研究動機……………………………………………………7
第二章、研究方法………………………………………………………9
第一節、研究設計……………………………………………………9
第二節、研究材料…………………………………………………12
一、 細胞株…………………………………………………………12
二、 病毒株…………………………………………………………12
三、 七種咖啡酸的類緣物…………………………………………13
四、 儀器……………………………………………………………13
第三節、實驗方法…………………………………………………14
一、 細胞培養………………………………………………………14
二、 放大病毒………………………………………………………14
三、 細胞存活率試驗………………………………………………14
四、 細胞病變抑制…………………………………………………15
五、 細胞凋亡實驗…………………………………………………16
六、 病毒產率試驗…………………………………………………17
七、 病毒斑試驗……………………………………………………17
八、 病毒顆粒活性試驗……………………………………………18
九、 病毒貼附試驗…………………………………………………18
十、 Time of addition assay………………………………………19
十一、 複製子小量質體DNA萃取……………………………20
十二、 複製子轉染細胞…………………………………………21
十三、 螢光顯微鏡觀察…………………………………………22
十四、 核酸萃取…………………………………………………22
十五、 反轉錄聚合酶連鎖反應…………………………………22
十六、 及時定量聚合酶連鎖反應………………………………23
 
第三章、研究結果…………………………………………………24
第一節、 咖啡酸與六種類衍物對TE671和BHK-21細胞的半毒殺劑量(CC50)……………………………………………………24
第二節、 篩選抗日本腦炎病毒的咖啡酸類衍物…………………24
一、 確定七種咖啡酸類衍物抑制JEV感染細胞的功效…………24
二、 確定咖啡酸與六種類衍物抑制JEV感染所造成細胞的凋亡………………………………………………………………25
第三節、 Caffeic acid 、 Chlorogenic acid、Gallic acid 、Ascorbic acid抗日本腦炎的功效…………………………………………25
一、 咖啡酸與其三種類衍物依照藥物濃度的增加抑制JEV感染細胞導致細胞產生病變……………………………………25
二、 咖啡酸與其三種類衍物藥物濃度的增加而抑制JEV感染細胞造成細胞凋亡…………………………………………………26
三、 咖啡酸類衍物抑制病毒的產量………………………………27
第四節、 具有JEV功效之咖啡酸類衍物對JEV的半抑制濃度…28
第五節、 確定四種咖啡酸類衍物(Caffeic acid、 Chlorogenic acid、Gallic acid 、Ascorbic acid)對於抗JEV是否有預防以及治療功效………………………………………………………………29
第六節、 確定四種咖啡酸類衍物(Caffeic acid、 Chlorogenic acid、Gallic acid 、Ascorbic acid)對於抗JEV是否有預防以及治療功效………………………………………………………………30
第七節、 確定咖啡酸類緣物影響細胞內病毒RNA合成………31
第八節、 利用JEV EGFP Replicon觀察細胞內JEV病毒驅動EGFP的表現……………………………………………………………31
第四章、 討論………………………………………………………33
第一節、 咖啡酸類衍物抗日本腦炎病毒的能力…………………33
第二節、 咖啡酸類衍物抑制日本腦炎病毒感染所引起的細胞凋亡…………………………………………………………………33
第三節、 咖啡酸類衍物對於細胞本身之影響……………………34
第四節、 日本腦炎病毒感染後Caffeic acid、Chlorogenic acid、Ascorbic acid、Gallic acid的影響………………………………34
第五節、 Caffeic acid、Chlorogenic acid 、Ascorbic acid、Gallic acid藥物處理後日本腦炎病毒感染的影響…………………………34
第五章、結論與建議…………………………………………………36
第一節、 結論………………………………………………………36
第二節、 未來展望…………………………………………………36
參考文獻………………………………………………………………87



圖目錄
圖一、實驗流程圖……………………………………………………11
圖二-A：Caffeic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………37
圖二-B：Chlorogenic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………38
圖二-C：Ascorbic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………39
圖二-D：Vallic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………40
圖二-E：Gallic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………41
圖二-F：Caffic acid phenethyl ester acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………42
圖二-G：Ferulic acid對於TE671細胞存活率的影響………………………………………………………………………43
圖二-H：Caffeic acid對於BHK-21細胞存活率的影響………………………………………………………………………44
圖二-I：Chlorogenic acid對於BHK-21細胞存活率的影響………………………………………………………………………45
圖二-J：Gallic acid對於BHK-21細胞存活率的影響………………………………………………………………………46
圖二-K：Ascorbic acid對於BHK-21細胞存活率的影響………………………………………………………………………47
圖三：咖啡酸及其類衍物(10µM) 抑制日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之細胞病變………………………………48
圖四：以流式細胞儀分析咖啡酸類衍物(10 µM)抑制日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之Sub-G1期……………49
圖五-A：Caffeic acid 和 Chlorogenic acid (0.1 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變……………………………………………………50
圖五-B：Caffeic acid 和 Chlorogenic acid (0.5 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變……………………………………………………51
圖五-C：咖啡酸與其三種類衍物(1 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變………………………………………………………………52
圖五-D：咖啡酸與其三種類衍物(5 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變………………………………………………………………53
圖五-E：咖啡酸與其三種類衍物(10 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變………………………………………………………………54
圖五-F：咖啡酸與其三種類衍物(50 µM)抑制日本腦炎病毒感染造成細胞病變………………………………………………………………55
圖六-A：以流式細胞儀分析caffeic acid對日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之Sub-G1期百分率的影響……………56
圖六-B：以Chlorogenic acid影響日腦炎病毒感染造成TE671細胞的凋亡情況………………………………………………………………57
圖六-C：以Gallic acid影響日腦炎病毒感染造成TE671細胞的凋亡情況……………………………………………………………………58
圖六-D：以Ascorbic acid影響日腦炎病毒感染造成TE671細胞的凋亡情況…………………………………………………………………59
圖七-A：以病毒斑點試驗分析caffeic acid對日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之上清液病毒效價影響及其抑制百分率………………………………………………………………………60
圖七-B：以病毒斑點試驗分析Chlorogenic acid對日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之上清液病毒效價影響及其抑制百分率……………………………………………………………62
圖七-C：以病毒斑點試驗分析Gallic acid對日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之上清液病毒效價影響及其抑制百分率………………………………………………………………………64
圖七-D：以病毒斑點試驗分析Ascorbic acid對日本腦炎病毒(MOI=0.5)在TE671細胞感染36小時候之上清液病毒效價影響及其抑制百分率 …………………………………………………………66
圖八：在不同濃度的處理下四種藥物Caffeic acid (A)、Chlorogenic acid(B)、Gallic acid (C)、Ascorbic acid (D) 和100 pfu/ml日本腦炎病毒同時處理進行plaque assay的實驗(Simultaneous treatment) ……69
圖九：在不同濃度四種藥物Caffeic acid (A)、Chlorogenic acid(B)、Gallic acid (C)、Ascorbic acid (D)的處理1小時再利用100pfu/ml的日本腦炎病毒處理進行plaque assay的實驗(pre-treatment)………70圖十：在100pfu/ml的日本腦炎病毒處理1小時再以不同濃度四種藥物Caffeic acid (A)、Chlorogenic acid(B)、Gallic acid (C)、Ascorbic acid (D) 處理進行plaque assay的實驗(Post-traetment) ……………73
圖十一：在先給藥1小時候移除藥物再病毒感染模式之Caffeic acid (A)、Chlorogenic acid(B)、Gallic acid (C)及Ascorbic acid (D)對日本腦炎病毒(100 pfu)斑點形成的抑制百分率…………………………75
圖十二：以病毒斑點試驗分析Caffeic acid (A) 和Chlorogenic acid (B)對日本腦炎病毒顆粒之直接毒殺活性……………………………76
圖十三：以病毒斑點試驗分析Caffeic acid (A)和Chlorogenic acid (B)影響日本腦炎病毒之細胞貼附………………………………………78
圖十四：Caffeic acid抑制細胞內JEV RNA的表現量………………80
圖十五： Caffeic acid (A)、Chlorogenic acid(B)、Gallic acid (C)以及Ascorbic acid (D)抑制JEV-EGFP Relicopon螢光蛋白的表現……………………………………………………………………83
 
表目錄
表一、咖啡酸與其類衍物之分子式及結構式………………………84
表二、咖啡酸與其類衍物在不同時間點給藥之IC50………………85
表三、本論文所使用的引子序列……………………………………86

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