臺灣博碩士論文加值系統

支撐型磷脂雙層膜(Supported lipid bilayer)是一種簡化平面人工細胞膜，應用於研究蛋白質與模擬細胞膜的作用。一般使用囊泡融合(vesicle fusion)方法製備。但由於其膜面積太大不易使用於螢光漂白回填實驗，且與基材間只有1奈米水層，對於研究穿透磷脂膜蛋白而言，1奈米水層限制蛋白質穿透部分的結構，而影響蛋白質的功能。另外，由於負電膜電性跟玻璃表面的負電相斥，所以製備上較困難。具流動性且隔離的磷脂雙層膜較能方便觀察蛋白質與細胞膜不同排列區域的作用情形。本實驗室曾使用刮除法及氣泡剝離法在磷脂雙層膜上形成隔離區塊。但此兩種方法以破壞細胞膜來形成隔離式磷脂雙層膜，其隔離的細胞膜邊緣結構殘缺不全，難以知道其排列情形。
本研究使用氣泡崩解沉降法(bubble collapse deposition)製備隔離式磷脂雙層膜。其方法是利用氣泡吸取水中磷脂，然後將氣泡移至乾淨玻璃上並緩慢抽掉空氣而形成的磷脂雙層膜。此方法製備的磷脂膜邊緣是由磷脂自然排列形成而非由急速破壞造成，所以情形單純。另外，也研究製備懸吊式磷脂雙層膜來排除基材的影響，以利研究穿透式膜蛋白。懸吊式磷脂雙層膜是利用磷脂在介於有機相及水相的微孔洞中排列而形成類似三明治模型的磷脂雙層膜，排除了基材干擾。
本研究使用氣泡崩解沉降法製備數種磷脂膜，包括電中性及負電性磷脂膜。藉由調控氣泡大小(1.5 μl ~ 2.5 μl)改變成型的磷脂膜大小(0.6 mm ~ 1.2 mm)，也由增加吸取磷脂量來增加膜的磷脂密度。其製備過程易受震動影響，所以要盡量避免桌面震動。另外也成功觀察到POPC懸吊式磷脂雙層膜的形成。藉由調控微孔洞大小(0.1 mm ~ 0.7 mm)改變成型磷脂模大小(0.1 mm ~ 0.7 mm)。磷脂膜容易因上下壓力差過大而破裂，所以製備懸吊式磷脂雙層膜要注意磷脂膜上下壓力是否相近。
在以氣泡崩解沉降法製備好的磷脂膜加入酵素觀察其與磷脂膜的作用情形。觀察到膜水解酵素phospholipase A2與流動性POPC膜作用較凝膠態DPPC膜慢。E. coli細胞壁合成酵素之一undecaprenyl pyrophosphate synthase (UPPs)在不同基質下與E. coli細胞膜的吸附能力不同，並觀察到其吸附並非完全隨機，會從點而面擴展。

A supported lipid bilayer (SLB) is a simplified, planar, and artificial membrane on a solid substrate. It is very useful for the study of protein-membrane interactions. The vesicle fusion method is the most convenient way to prepare SLB. However, SLB prepared by the vesicle fusion has three disadvantages. First, the area of the membrane is too large for the study using fluorescence recovery after photobleaching on fluid membrane. Second, the thickness of the water layer between the membrane and the substrate is only about one nanometer, too thin to study transmembrane protein. Third, it is difficult to prepare a negatively charged lipid bilayer on a glass substrate, whose surface is also negatively charged. A fluid and micron-sized lipid bilayer is desirable for the observation of protein-membrane interactions by microscope. We had used knife stripping and air bubble stripping to create small snd isolated membrane, but these two methods caused irreproducible destructions on the edges of lipid bilayers.
We therefore set up the method of bubble collapse deposition (BCD) to prepare isolated lipid bilayers in small sizes. The method involves three steps: First, an air bubble is touched to a lipid bilayer and then is covered by a monolayer of phospholipid. Second, the phospholipid covered air bubble is moved underwater to another clean glass plate. Third, the air is slowly withdrawn from the air bubble and a lipid bilayer is formed by bubble collapse deposition. We also developed a method to create suspended lipid bilayers for the study of transmembrane protein. A suspended lipid bilayer was prepared on a microhole between the interface of organic solvent and water.
We used bubble collapse deposition to produce several isolated bilayers of various phospholipids, such as 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn- glycero-3- phosphocholine (POPC) and E. coli membrane lipids. We controlled the air bubble volume (1.5 μl ~ 2.5 μl) to create bilayers with different sizes (0.6 mm ~ 1.2 mm in diameter) and increased the density of the BCD bilayer by increasing the contact time and area of the air bubble with the lipid source bilayer. We found that vibration on the platform of the setup will lead to failed experiments. In addition, a suspended POPC lipid bilayer was successfully formed on the microhole in the interface of n-decane and water. The size of the microhole was changed from 0.1 mm ~ 0.7 mm in diameter. The pressure difference between the organic and water interface can easily destroy the suspended lipid bilayer. So the pressure balance on the two sides of the bilayer is important.
For applications, we added enzymes to the prepared membrane to examine the interactions between the enzymes and the membrane. We observed that phospholipase A2 hydrolyzed the fluid POPC bilayer more slowly than the gel-state DPPC bilayer. E. coli undecaprenyl pyrophosphate synthase (UPPs), a water soluble enzyme, adsorb to the bilayer of E. coli membrane extract to different extent under the presence of different substrates. The adsorption did not happen in a totally random way but expanded from points to areas.

總目錄

中文摘要 I
英文摘要 III
總目錄 V
圖表目錄 IX
第一章 緒論 1
1.1 細胞膜簡介 1
1.2 支撐型磷脂雙層膜的生成機制 4
1.3 膜催化水解酵素簡介 5
1.4 細菌細胞壁合成酵素簡介 8
1.5 研究動機與目的 10
第二章 實驗設計與方法 11
2.1 實驗儀器 11
2.1.1 倒立式螢光顯微鏡 11
2.1.2 實驗架設 12
2.2 實驗設計 16
2.3 實驗方法 21
2.3.1 蓋玻片的清洗 21
2.3.2 樣品槽的製作 22
2.3.3 氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜 22
2.3.3.1利用囊泡融合法製備預先製備磷脂雙層膜 22
2.3.3.2 氣泡崩解沉降法 23
2.3.4 微孔洞裝置的製作 26
2.3.5 利用微孔洞裝置製備懸吊式磷脂雙層膜 27
2.3.6 實驗樣品 29
2.3.6.1 使用的磷脂種類 29
2.3.6.2 螢光標定物 32
2.3.6.3 緩衝溶液成分 33
第三章 隔離式磷脂雙層膜 34
3.1 氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜 34
3.1.1 在不同尺寸針頭情況下，利用氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜 34
3.1.2 利用尖端物質在氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜上刮出隔離區塊 37
3.1.3 利用囊泡溶液做為氣泡崩解沉降法的磷脂源 39
3.1.4 增加氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜的磷脂密度 42
3.1.4.1 多次重疊氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜 44
3.1.4.2 增加氣泡拖曳的距離及時間 46
3.1.5 震動對氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜的影響 48
3.1.6 利用氣泡崩解沉降法製備不同磷脂成分的雙層膜 50
3.1.6.1 POPC磷脂雙層膜 50
3.1.6.2 大腸桿菌細胞膜的磷脂雙層膜 51
3.1.6.3 DPPC磷脂雙層膜 52
3.1.6.4 混合成分的負電磷脂雙層膜 55
3.2 觀察膜水解酵素在氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜上的作用情形 58
3.2.1 膜水解酵素與囊泡融合法及氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜作用情形的比較 58
3.2.2 膜水解酵素在氣泡崩解沉降法製備的流動性磷脂雙層膜和非流動性磷脂雙層膜上作用情形的比較 62
3.3 觀察UPPs在氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜上的作用情形 65
3.3.1 觀察UPPs在大腸桿菌磷脂單層膜上的作用情形 65
3.3.2 觀察UPPs在各種形態下與磷脂雙層膜的作用情形 69
3.3.2.1 UPPs與大腸桿菌磷脂雙層膜的作用 69
3.3.2.2 UPPs + FPP 在大腸桿菌磷脂雙層膜上的作用情形 71
3.3.2.3 UPPs : FPP : IPP (1 : 1 : 8) 在大腸桿菌磷脂雙層膜上的作用情形 77
3.3.2.4 UPPs : FPP : IPP (1 : 10 : 80) 在大腸桿菌磷脂雙層膜上作用的情形 79
3.3.2.5 UPPs + FPP + IPP在大腸桿菌磷脂雙層膜上的作用情形分析 81
第四章 懸吊式磷脂雙層膜 84
4.1 利用微孔洞裝置製備懸吊式磷脂雙層膜 84
4.1.1 懸吊式磷脂雙層膜 84
4.1.2 延長懸吊式磷脂雙層膜的生命期 87
第五章 結論 90
5.1 氣泡崩解沉降法製備隔離式磷脂雙層膜 90
5.1.1 氣泡崩解沉降法製備隔離式磷脂雙層膜 90
5.1.2 膜水解酵素在氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜上的作用情形 90
5.1.3 UPPs在氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜上的作用情形 91
5.2 微孔洞裝置製備懸吊式磷脂雙層膜 91
參考資料 93

圖目錄

中文摘要 I
英文摘要 III
總目錄 V
圖表目錄 IX
第一章 緒論 1
圖1-1 兩性分子的主要排列結構 3
圖1-2 囊泡融合法製備支撐型磷脂雙層膜的主要機制 4
圖1-3 sPLA2催化水解POPC磷脂的反應式 6
圖1-4 sPLA2催化水解磷脂雙層膜的過程模擬圖 7
圖1-5 UPPs縮合1個FPP及8個IPP的反應式 9
第二章 實驗設計與方法 11
圖2-1 倒立式螢光顯微鏡剖面圖 11
圖2-2 實驗架設模型圖 12
圖2-3 激發濾片的穿透光譜 13
圖2-4 Dichroic mirror的穿透光譜 13
圖2-5 放光濾片的穿透光譜 14
圖2-6 未隔離的磷脂雙層膜及隔離的磷脂雙層膜進行光漂白後的模擬圖 18
圖2-7 實驗室之前製作隔離式磷脂雙層膜的兩種方法及螢光影像 18
圖2-8 氣泡崩解沉降法製備的磷脂雙層膜的模擬圖及螢光影像 19
圖2-9 穿透式磷脂膜蛋白質與磷脂雙層膜作用的模擬圖 20
圖2-10 中孔螺旋蓋的玻璃基材 22
圖2-11 利用囊泡融合法製備磷脂雙層膜的步驟 25
圖2-12 利用氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜的步驟 25
表2-1 利用氣泡崩解沉降法製備不同流動性磷脂雙層膜的條件比較 26
圖2-13 微孔洞裝置架設圖 27
圖2-14 利用微孔洞裝置製備懸吊式磷脂雙層膜的步驟 28
圖2-15 本研究使用的螢光標定物性質 32
第三章 隔離式磷脂雙層膜 34
圖3-1 不同尺寸針頭下氣泡崩解沉降法製備的POPC磷脂膜的螢光影像 36
圖3-2 利用鎢鋼刀在不同方法製備的POPC磷脂雙層膜上形成隔離區塊 38
圖3-3 利用囊泡溶液及氣泡崩解沉降法製備POPC磷脂膜的螢光影像 40
圖3-4 單純玻璃表面的螢光影像及以囊泡融合磷脂雙層膜為磷脂源以氣泡崩解沉降法製備磷脂雙層膜的螢光影像 41
圖3-5 利用氣泡崩解沉降法製備POPC磷脂雙層膜，氣泡僅沾取固定一個位置上的磷脂 43
圖3-6 重疊三塊氣泡崩解沉降法製備的POPC磷脂雙層膜 45
圖3-7 氣泡崩解沉降法製備POPC磷脂雙層膜的螢光影像 47
表3-1 不同條件氣泡崩解沉降法製備不同相轉變溫度的磷脂雙層膜 47
圖3-8 震動對氣泡崩解沉降法製備POPC磷脂雙層膜的影響 49
圖3-9 減少震動影響下氣泡崩解沉降法製備的POPC磷脂雙層膜 49
圖3-10 利用氣泡崩解沉降法製備的POPC磷脂雙層膜 50
圖3-11 利用氣泡崩解沉降法製備大腸桿菌細胞膜的磷脂雙層膜 52
圖3-12利用氣泡崩解沉降法製備DPPC磷脂雙層膜的螢光影像 54
圖3-13利用氣泡崩解沉降法製備混合成份的POPC + DOPS磷脂雙層膜 56
圖3-14 利用氣泡崩解沉降法製備混合成份的POPC + POPS磷脂雙層膜 56
圖3-15 利用氣泡崩解沉降法製備混合成份的DLPE + DOPG磷脂雙層膜 57
圖3-16 PLA2在囊泡融合法及氣泡崩解沉降法製備的DPPC磷脂雙層膜上的作用比較 60
圖3-17 PLA2與氣泡崩解沉降法及囊泡融合法製備磷脂雙層膜的作用模型 61
圖3-18 PLA2在氣泡崩解沉降法製備的DPPC及POPC + POPS磷脂雙層膜上的作用比較 63
圖3-19 PLA2在凝膠態及流動性磷脂雙層膜上的作用模型圖 64
圖3-20 Langmuir-Blodgett裝置模擬圖 67
圖3-21 Langmuir-Blodgett trough製備的磷脂單層膜的表面張力變化圖 68
圖3-22 UPPs加入磷脂雙層膜後，隨時間變化的螢光影像 70
圖3-23 UPPs加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上螢光強度隨時間的變化圖 70
圖3-24 UPPs結構側視圖 73
圖3-25 UPPs胺基酸序列 74
圖3-26 UPPs (10 nM) + FPP (10 nM)加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜螢光影像隨時間變化 75
圖3-27 UPPs (10 nM) + FPP (10 nM)加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上螢光強度隨時間的變化圖 75
圖3-28 UPPs (5 nM) + FPP (5 nM)加入大腸桿菌磷脂膜後，膜螢光影像隨時間變化 76
圖3-29 UPPs (5 nM) + FPP (5 nM)加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上螢光強度隨時間的變化圖 76
圖3-30 UPPs : FPP : IPP (1 : 1 : 8) 加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上螢光隨時間的變化 78
圖3-31 UPPs : FPP : IPP (1 : 1 : 8) 加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上螢光強度隨時間的變化圖 78
圖3-32 UPPs : FPP : IPP (1 : 10 : 80) 加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜上隨時間變化的螢光影像 80
圖3-33 UPPs : FPP : IPP (1 : 10 : 80) 加入大腸桿菌磷脂雙層膜後，膜螢光強度隨時間的變化圖 80
圖3-34 分析UPPs (5 nM) + FPP (5 nM) + IPP (40 nM)加入大腸桿菌磷脂膜後的螢光影像，並以吸附時間對吸附面積以及吸附面積對螢光強度做圖 82
第四章 懸吊式磷脂雙層膜 84
圖4-1 懸吊式磷脂雙層膜隨時間變化的白光影像 86
圖4-2 兩次實驗製作懸吊式磷脂雙層膜的面積隨時間的變化圖 86
圖4-3 在已生成的懸吊式磷脂雙層膜上再加入磷脂溶液後的白光影像 88
圖4-4 懸吊式磷脂雙層膜隨時間變化的白光影像 89
圖4-5 懸吊式磷脂雙層膜面積隨時間的變化圖 89
第五章 結論 90
參考資料 93

參考文獻

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